冷凍電鏡解析高分辨率RNA結(jié)構(gòu)

作為強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)解析工具，冷凍電鏡在解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有超強(qiáng)能力。RNA作為另外一種生物大分子，在生命活動中發(fā)揮著與蛋白質(zhì)同等關(guān)鍵的作用，解析它們的三維結(jié)構(gòu)也是科學(xué)家們持久探索的問題。但RNA由于分子量小，柔性大等因素，無論是依靠冷凍電鏡還是其他結(jié)構(gòu)解析手段，這一目的在往日很難實(shí)現(xiàn)。近日，哈佛大學(xué)廖茂富博士和尹鵬博士合作，利用ROCK技術(shù)改造RNA，賦能冷凍電鏡技術(shù)，解析了多種RNA的高分辨結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步擴(kuò)展了冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用場景，也為揭示RNA參與的生命活動，以及圍繞RNA的藥物開發(fā)，打開了全新局面。

作為遺傳分子DNA的姊妹，RNA支持著我們生活的世界。進(jìn)化生物學(xué)家曾提出假設(shè)，認(rèn)為在DNA和它所編碼的蛋白質(zhì)出現(xiàn)之前，RNA就已經(jīng)存在并具有自我復(fù)制功能。而現(xiàn)代科學(xué)發(fā)現(xiàn)，只有不到3%的人類基因組被轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)分子，并在后續(xù)被翻譯成蛋白質(zhì)。相比之下，82%的基因組被轉(zhuǎn)錄成具有其他未知功能的RNA分子。

為了了解單個RNA分子的功能，在原子和分子鍵的層面上對其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析是極其必要的。通過對DNA和蛋白質(zhì)分子進(jìn)行結(jié)晶處理，研究人員已經(jīng)可以通過X射線晶體學(xué)方法或核磁共振方法進(jìn)行常規(guī)的結(jié)構(gòu)研究。然而，由于RNA的分子構(gòu)成和結(jié)構(gòu)柔性特點(diǎn)，它們往往難以結(jié)晶，因此這些需要結(jié)晶的方法并不適用于解析RNA分子的結(jié)構(gòu)。 

近日，哈佛大學(xué)韋斯生物啟發(fā)工程研究所(Wyss)的尹鵬博士和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院(HMS)的廖茂富博士合作完成了一項研究，報告了一種對RNA分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究的新技術(shù)"ROCK"。該技術(shù)可以將多個相同的RNA分子組裝成一個高度組織化的結(jié)構(gòu)，大大降低單個RNA分子的靈活性，并使其分子量成倍增加。應(yīng)用于具有不同大小和功能的知名模型RNA作為基準(zhǔn)，該團(tuán)隊表明ROCK技術(shù)能夠?qū)⒗鋬鲭婄R (cryo-EM) 方法應(yīng)用在包含RNA亞基的生物大分子的結(jié)構(gòu)解析上。他們的研究結(jié)果發(fā)表在《自然-方法》上。與廖茂富博士一起領(lǐng)導(dǎo)這項研究的尹鵬博士說:「ROCK技術(shù)正在打破目前針對RNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究的限制，使RNA分子的近原子級分辨率結(jié)構(gòu)得以揭示，這一過程往往難以甚至無法用傳統(tǒng)的方法實(shí)現(xiàn)。我們期望這一進(jìn)展能為基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)的許多領(lǐng)域注入活力，包括正在蓬勃發(fā)展的RNA療法?！?nbsp;

獲得對RNA的控制權(quán) 

尹鵬博士的研究團(tuán)隊開發(fā)了多種方法，包括DNA磚塊和DNA折紙術(shù)，這些方法使DNA和RNA分子能夠根據(jù)不同的規(guī)則和需求進(jìn)行自我組裝，從而形成超大分子。他們假設(shè)，這種策略也能夠?qū)⒆匀淮嬖诘腞NA分子組裝成高度有序的環(huán)形復(fù)合物，通過將特定分子連接在一起的方式，對柔性進(jìn)行限制。許多RNA以復(fù)雜但可預(yù)測的方式折疊，在小片段之間進(jìn)行堿基配對交互。其結(jié)果往往會將穩(wěn)定的 "核心 "和 "莖環(huán) "向圓環(huán)外側(cè)凸出。

在ROCK技術(shù)(通過吻式發(fā)夾實(shí)現(xiàn)RNA寡聚化后冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析)中，目的RNA被設(shè)計成通過吻式發(fā)夾序列(紅色)自組裝成一個封閉的同源環(huán)，這些序列定位在在功能非必要的外周螺旋上(藍(lán)色)。在確定了可編輯的非必要外周螺旋后，連接吻式發(fā)夾模體和目的RNA核心的螺旋的長度被計算優(yōu)化。帶有目的RNA的多個單獨(dú)亞基的RNA構(gòu)建體被轉(zhuǎn)錄、組裝，通過凝膠電泳純化，并通過冷凍電鏡進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。 

「在我們的方法中，我們構(gòu)建了吻式發(fā)夾，可以將同一RNA兩個拷貝的不同外圍莖環(huán)連接起來，使之形成一個整體穩(wěn)定的環(huán)，其中包含了目的RNA的多個拷貝。我們推測，這些高階環(huán)可以通過冷凍電鏡進(jìn)行高分辨率結(jié)構(gòu)解析，該技術(shù)已成功應(yīng)用于RNA分子的結(jié)構(gòu)解析。」 —劉迪，第一作者 描繪穩(wěn)定的RNA 在冷凍電鏡方法中，許多生物大分子的單一顆粒在低溫下被瞬間凍結(jié)，以阻止它們的運(yùn)動。隨后，在電子顯微鏡和計算算法的幫助下，對顆粒各個方向的二維表面投影進(jìn)行比較，以重建其三維結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)生物大分子的可視化。彭和劉與廖和他的前研究生弗朗索瓦·塞洛(Fran?ois Thélot)博士合作進(jìn)行了該工作，后者是該研究的另一位第一作者。廖和他的團(tuán)隊在冷凍電鏡領(lǐng)域、以及對特定蛋白質(zhì)形成的單顆粒的實(shí)驗(yàn)和計算分析中做出了重要貢獻(xiàn)。 

廖茂富說:「與傳統(tǒng)方法相比，冷凍電鏡在解析包括蛋白質(zhì)、DNA和RNA在內(nèi)的生物分子的高分辨率結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)方面有很大的優(yōu)勢，但是大多數(shù)RNA的小分子量和高柔性使其結(jié)構(gòu)難以解析。我們組裝RNA多聚體的新方法同時解決了這兩個問題，通過增加RNA的分子量，并降低其柔性，我們的方法為基于冷凍電鏡方法解析RNA結(jié)構(gòu)這一領(lǐng)域打開了大門?！褂捎谡狭薘NA納米技術(shù)和冷凍電鏡方法，該團(tuán)隊將這一復(fù)合技術(shù)命名為"ROCK" (RNA oligomerization-enabled cryo-EM via installing kissing loops, 通過吻式發(fā)夾實(shí)現(xiàn)RNA寡聚化后冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析)。 

為了證實(shí)ROCK技術(shù)的可行性，該團(tuán)隊將研究聚焦于四膜蟲(一種單細(xì)胞生物)的大內(nèi)含子RNA和固氮弧菌(一種固氮細(xì)菌)的小內(nèi)含子RNA，以及FMN核糖開關(guān)。內(nèi)含子RNA是散布在新轉(zhuǎn)錄RNA序列中的非編碼RNA序列，必須被 "剪接"出來才能形成成熟RNA。FMN核糖開關(guān)存在于一些細(xì)菌RNA中，這些細(xì)菌會參與由維生素B2衍生的黃素代謝物的生物合成。在與RNA結(jié)合后，黃素單核苷酸(FMN)將切換其三維構(gòu)象，并抑制其母RNA的合成。在對四膜蟲 I 組內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)解析過程中，研究人員收集了約十萬張ROCK技術(shù)處理的單顆粒冷凍電鏡圖像，通過一系列計算分析步驟重建了其結(jié)構(gòu)，整體分辨率達(dá)到了2.98?，結(jié)構(gòu)核心的分辨率達(dá)到了2.85?。終的模型提供了四膜蟲 I 組內(nèi)含子的詳細(xì)視圖，包括之前未知的外圍結(jié)構(gòu)域(以土黃色和紫色顯示)，它們構(gòu)成了圍繞核心的條帶。 研究小組稱，他們將四膜蟲 I 組內(nèi)含子組裝成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使樣品更加均勻，并能夠利用組裝結(jié)構(gòu)的對稱性來進(jìn)行計算。雖然數(shù)據(jù)采集兩的規(guī)模并不大，但ROCK技術(shù)的優(yōu)勢使研究小組能夠以前所未有的分辨率解析該結(jié)構(gòu)。RNA的核心結(jié)構(gòu)以2.85?的分辨率解析，揭示了核苷酸堿基和糖骨架結(jié)構(gòu)的詳細(xì)特征。研究小組還稱如果沒有ROCK技術(shù)加持，在當(dāng)前的資源條件下，他們不可能做到這一點(diǎn)。 冷凍電鏡還能夠捕捉不同構(gòu)象的分子。研究小組通過將ROCK方法應(yīng)用于固氮弧菌內(nèi)含子RNA和FMN核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)解析中，確定了固氮弧菌內(nèi)含子在其自我剪切過程中的不同構(gòu)象，揭示了FMN核糖開關(guān)配體結(jié)合部位的相對剛性的構(gòu)象。 這項研究生動演示了RNA納米技術(shù)如何推動著其他學(xué)科的發(fā)展。將天然狀態(tài)的RNA分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化，對理解不同細(xì)胞類型、組織和生物體的生物及病理過程產(chǎn)生巨大的影響，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)新的藥物開發(fā)方法。