合成生物標志物：未來的早期癌癥檢測方法

前言

在癌癥仍處于局部狀態(tài)的早期檢測可改善大多數(shù)癌癥類型患者對醫(yī)療干預(yù)的反應(yīng)。宮頸細胞學等篩查工具在降低死亡率方面的成功，引發(fā)了人們對早期檢測新方法的極大興趣（例如，使用非侵入性血液或生物流體生物標記物）。然而，從早期病變中產(chǎn)生的生物標志物受到基本的生物和運輸障礙的限制，例如循環(huán)時間短和血液中的稀釋，需要高靈敏度的方法來檢測非常低的信號水平。此外，個體生物標記物通常缺乏特異性，它們在非癌性條件下可能會升高，或者在多種癌癥中存在，這就需要識別多種分析物組合以評估疾病。

這些經(jīng)驗教訓為基于生物工程傳感器（如分子探針或基因編碼載體）設(shè)計的新興診斷提供了依據(jù)，這些傳感器利用了早期腫瘤或其前體的失調(diào)特征，產(chǎn)生一個放大的信號，這些外源性傳感器利用腫瘤依賴性激活機制，如酶放大，來驅(qū)動合成生物標記物的產(chǎn)生和放大。癌癥也可以通過成像系統(tǒng)進行檢測，這些系統(tǒng)可能具有合成生物標記物方法的基本特征，例如報告基因成像。這些新興的技術(shù)推動了早期癌癥檢測的發(fā)展，合成生物標志物可能成為未來的早期癌癥檢測方法。

早期癌癥發(fā)現(xiàn)的挑戰(zhàn)

早期癌癥檢測對于持續(xù)脫落的生物標記物，如蛋白質(zhì)，患者腫瘤的生物標記物并非普遍呈陽性，即使對于相同腫瘤類型的細胞，分泌率也可能變化多達四個數(shù)量級。此外，由死亡細胞釋放的生物標記物只會脫落一次，它們的檢測與健康組織的背景脫落很容易混淆。例如，細胞游離DNA（cfDNA）是從全身非癌細胞中釋放出來的，這使得惡性細胞與正常細胞的體細胞突變比例或變異等位基因頻率（VAF）在低腫瘤負荷下越來越難以檢測。

通過治療追蹤非小細胞肺癌進展研究的分析預(yù)測，1、10或100cm3的原發(fā)腫瘤負荷將導致平均血漿VAF分別為0.006%、0.1%或1.3%。對于典型的4毫升血漿，據(jù)估計，每管平均只有6個分子攜帶相應(yīng)的體細胞突變。進一步加劇技術(shù)挑戰(zhàn)的是，生物標記物被大量血液稀釋，導致在循環(huán)中被降解或清除，例如，ctDNA在血液中的循環(huán)半衰期不到1.5小時。

雖然，基于數(shù)學模型預(yù)測和基因組時間線研究一致估計了至少十年的早期癌癥檢測機會窗口。但是，快速生長和高度侵襲性的癌癥，可能會在幾個月到幾年的相對狹窄窗口內(nèi)迅速進展，并與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。例如三陰性乳腺癌和高度漿液性卵巢癌（HGSOC），其腫瘤具有BRCA1或BRCA2突變，或同源重組缺陷。合成生物標志物研究領(lǐng)域的進展旨在應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，主要方法是利用基于活性或基因編碼的機制進行早期檢測。

基于活性分子的合成生物標志物

用外源性藥物全身給藥來評估體內(nèi)生物功能有著悠久的臨床歷史?；诨钚缘暮铣缮飿擞浳锞突谶@種模式，包括由腫瘤或其微環(huán)境中的酶激活的傳感器和小分子探針，以提供腫瘤生物標記物的分子放大機制。

蛋白酶激活的合成生物標記物

蛋白酶激活的合成生物標記物包括結(jié)合到惰性載體表面的肽底物，該載體在被腫瘤蛋白酶酶切后釋放報告物到血液或尿液中進行檢測。除了分子信號放大之外，達到早期檢測所需檢測限（LOD）的另一個關(guān)鍵策略是利用人體生理學特征來增加生物流體中的合成生物標記物濃度。一種方法是通過選擇流體動力學半徑大于腎小球濾過屏障（~5nm）的載體，利用腎臟的大小過濾，以防止表面結(jié)合肽被清除到尿液中。

另一個關(guān)鍵策略是加強被動遞送到腫瘤部位。例如使用聚乙二醇（PEG）聚合物加氧化鐵納米顆粒（IONPs）具有更高的被動擴散速率，可以增加對腫瘤的輸送。另一種方法是利用腫瘤穿透配體使傳感器功能化，這些配體參與到腫瘤微環(huán)境的活躍運輸途徑。

蛋白酶是一種混合酶，能夠切割多種底物序列，這限制了單個傳感器的檢測特異性。因此，另一個關(guān)鍵設(shè)計原則是設(shè)計一個多傳感器庫，通過特征分析檢測癌癥。這種方法要求傳感器庫中的每個合成生物標記物都用獨特的分子進行標記。

小分子探針

鑒于越來越多的腫瘤特異性抗原、細胞表面標記物和代謝途徑可作為小分子的靶點，一些研究重點放在工程化分子探針，以生成用于癌癥檢測的合成生物標記物。

30多年來，穩(wěn)定同位素標記的小分子被廣泛用作研究實驗室的診斷探針。穩(wěn)定同位素標記的優(yōu)點包括：對患者沒有輻射風險，與未經(jīng)修飾的對應(yīng)物相比代謝沒有差別，以及高信噪比。FDA已經(jīng)批準了幾種同位素標記探針，包括13C-methacetin和13C-cholate，它們分別測量肝細胞色素P450活性和肝分流，用于測量肝纖維化背景下的肝功能障礙，肝纖維化是肝細胞癌的一個重要風險因素。

患者呼吸樣本中存在的天然揮發(fā)性有機化合物（VOCs）也已用于癌癥診斷。Lang等人使用了一種同位素標記的合成VOC，稱為“D5乙基-β-D-葡糖苷酸”（EtGlu），它是乙醇的氘化代謝物。靜脈注射后，EtGlu通過β-葡萄糖醛酸酶（一種由實體瘤分泌的胞外酶）酶轉(zhuǎn)化為D5乙醇，然后通過氣相色譜結(jié)合高分辨率質(zhì)譜從呼吸中檢測。

基因編碼的合成生物標志物

哺乳動物合成生物學的進步正在推動生物傳感的發(fā)展。除了基于活性的探針外，基因編碼的結(jié)構(gòu)還形成了另一組主要策略，使用工程組件或細胞來放大合成生物標記物的釋放。這些方法側(cè)重于驅(qū)動腫瘤微環(huán)境中的常駐細胞或浸潤細胞產(chǎn)生或分泌生物正交報告物的策略。這些方法的主要優(yōu)點是能夠?qū)⒑铣缮飿擞浳锏漠a(chǎn)生轉(zhuǎn)錄到特定表型的細胞，從而潛在地減少健康組織中由背景產(chǎn)生引起的假陽性數(shù)量。目前，有三大類用于產(chǎn)生合成生物標記物的基因編碼系統(tǒng)，包括基于載體的系統(tǒng)、基于哺乳動物細胞的系統(tǒng)和基于細菌細胞的系統(tǒng)。

基于載體的合成生物標記物

基于載體的系統(tǒng)依賴于兩個關(guān)鍵設(shè)計組件：一個組織選擇性或癌癥選擇性啟動子來驅(qū)動轉(zhuǎn)錄，一個合成生物標記物被設(shè)計成分泌到血液或尿液中用于檢測。組織選擇性啟動子提供了第一水平的特異性，例如正常沉默的人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的啟動子，它編碼端粒酶，端粒酶在癌細胞中經(jīng)常被激活以實現(xiàn)增殖永生，這是癌癥的標志之一。由于TERT在約90%的人類癌癥中高水平表達，但在幾乎所有的體細胞中都被沉默，因此TERT啟動子已被用于驅(qū)動多種腫瘤細胞中的基因表達。

基于載體策略的第二個組成部分是作為合成生物標記物的分泌報告物，可以在血液或尿液中檢測到。分泌型胚胎堿性磷酸酶（SEAP）是第一批被設(shè)計用于體內(nèi)應(yīng)用的報告物之一。SEAP是人類胎盤堿性磷酸酶的一種工程形式，在膜錨定結(jié)構(gòu)域包含一個終止密碼子，將其轉(zhuǎn)化為一個截短但完全活躍的分泌型報告物。在異種移植腫瘤模型中，SEAP水平與腫瘤大小和細胞數(shù)量直接相關(guān)。另一個常用的報告物是熒光素酶。

基于哺乳動物細胞的合成生物標記物

近過繼細胞療法的臨床成功激發(fā)了工程化哺乳動物細胞作為活體生物傳感器的嘗試。細胞作為診斷載體的一個明顯優(yōu)勢是，與分子探針相比，一些細胞能夠定位并浸潤癌癥部位，而分子探針依賴于血管系統(tǒng)的被動擴散來積聚在腫瘤中，因此受到限制。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）是具有再生和免疫調(diào)節(jié)特性的成年多能干細胞，Liu等人使用小鼠模型證明了工程化MSC可用于檢測血液中的癌癥轉(zhuǎn)移。首先，MSCs被設(shè)計成分泌人源化谷氨酸，靜脈注射后，與無腫瘤小鼠相比，乳腺癌肺轉(zhuǎn)移小鼠體內(nèi)的工程化MSC持續(xù)時間更長，導致人源化Gluc的血液水平更高。然而，由于MSCs對炎癥和損傷部位表現(xiàn)出趨化性，或自身可能參與癌癥進展，因此需要更多的研究來了解這些潛在的局限性。

Aalipour等人進一步發(fā)展了基于細胞的診斷概念，使用工程化巨噬細胞作為活細胞傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2型重編程導致精氨酸酶1（由ARG1編碼）水平發(fā)生顯著變化，而在實體瘤中過繼轉(zhuǎn)移的巨噬細胞可將精氨酸酶1上調(diào)多達200倍?；谶@一發(fā)現(xiàn)，他們使用ARG1啟動子在巨噬細胞M2極化時驅(qū)動谷氨酸的產(chǎn)生。這項研究為細胞免疫診斷的概念奠定了基礎(chǔ)，考慮到許多其他免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中同樣調(diào)節(jié)代謝基因的表達，這種方法也可以擴展到T細胞、B細胞和自然殺傷細胞。

基于細菌的合成生物標記物

某些類型的細菌滲透并選擇性地在腫瘤中生長，這歸因于抑制免疫監(jiān)視和實體瘤核心內(nèi)壞死細胞釋放的營養(yǎng)素水平增加。這促使人們使用工程化腫瘤靶向細菌作為癌癥檢測的可編程載體。

Panteli等人對一種腸道沙門氏菌減毒菌株進行了基因改造，其毒性比野生型菌株低10000倍，可以釋放出作為熒光生物標記物或“熒光標記物”的ZsGreen。在對荷瘤小鼠進行靜脈給藥后，血清中的熒光標記物水平取決于腫瘤質(zhì)量，可通過數(shù)學建模預(yù)測其檢測腫瘤的能力。

細菌用于早期癌癥檢測仍需要應(yīng)對幾個挑戰(zhàn)。盡管包括梭菌、大腸桿菌和沙門氏菌在內(nèi)的工程菌株已被證明對動物和人類無致病性，但細菌成分的固有毒性和恢復(fù)毒性的可能性帶來了安全問題。此外，目前還不清楚是否所有缺乏壞死核心的腫瘤類型和新生病變都能被系統(tǒng)輸送的細菌定植。

合成生物學的進步可以提供這些挑戰(zhàn)的解決方案，同時也為設(shè)計具有特定和受控行為的“智能”微生物提供了機會。例如，使用群體感應(yīng)生物電路設(shè)計的細菌可用于細菌通信，以同步活動，并產(chǎn)生緊急行為，如在達到閾值種群密度后，定時釋放治療藥物，以殺死腫瘤或促進系統(tǒng)性抗腫瘤免疫。應(yīng)用于早期癌癥檢測領(lǐng)域，這些生物電路有可能通過降低健康組織的背景活性來增加特異性。在未來，這些基因可編程載體可能有潛力被開發(fā)成安全和定期攝入的食品（例如酸奶），以便進行常規(guī)癌癥篩查或癌癥化學預(yù)防。

合成生物標志物的臨床前研究

已有大量臨床前研究報告表明，基于活性的合成生物標記物具有實現(xiàn)早期檢測所需LOD的潛力。

在異種移植小鼠模型中，由IONPs與獨特肽底物結(jié)合組成的基于活性的傳感器能夠識別LS174T大腸腫瘤，其體積比血清生物標記物CEA檢測到的體積小60%。Kwon等人報道了一種基于活性分子的傳感器，該傳感器結(jié)合了腫瘤穿透肽，在原位卵巢癌模型中靶向并增加其對轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的傳遞，以進一步降低LOD。通過量化尿液中富集的合成生物標記物，他們報告了當中位結(jié)節(jié)直徑小于2mm且平均總腫瘤負荷為36 mm3時，以近乎完美的精確度（AUROC為0.99）檢測腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。相比之下，只有當平均腫瘤負荷達到88 mm3時，人類附睪蛋白4（HE4）血清生物標記物才能指示腫瘤轉(zhuǎn)移。

關(guān)于基因編碼的合成生物標記物的體內(nèi)LOD研究也有報道。Aalipour等人的研究表明，過繼轉(zhuǎn)移的工程化巨噬細胞傳感器檢測到中等大小的CT26大腸腫瘤（體積50–250 mm3），其敏感性和特異性為，在將其巨噬細胞傳感器的性能與LS174T腫瘤分泌的血漿CEA或CT26腫瘤釋放的cfDNA進行比較的基準研究中，他們報告了較低的LOD。CEA可檢測到體積約136 mm3的腫瘤，而cfDNA可檢測到體積大于1500 mm3的腫瘤。

合成生物標志物的臨床研究

由于該領(lǐng)域尚處于起步階段，合成生物標記物的人體應(yīng)用尚未進入關(guān)鍵試驗。目前，在臨床試驗中進展快的合成生物標記物是聚乙二醇化肽，根據(jù)近一期研究的初步數(shù)據(jù)，健康志愿者對其耐受性良好且安全。

合成生物標記物的前幾個臨床應(yīng)用案例需要仔細考慮，因為早期失敗可能會使該領(lǐng)域倒退。篩查無癥狀患者的早期癌癥是一項極具挑戰(zhàn)性的工作，在臨床試驗驗證研究中可能會帶來倫理挑戰(zhàn)。例如，合成生物標記物檢測結(jié)果呈陽性的患者可能需要等待成像確認（即允許腫瘤生長），然后才能進行治療干預(yù)。潛在的臨床切入點，如治療反應(yīng)的藥效學評估或切除術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測，可以檢測合成生物標記物方法的效用。

值得注意的是，隨著該領(lǐng)域向人體試驗的發(fā)展，構(gòu)成合成生物標記物的許多組件和載體正在進行臨床評估，在人體內(nèi)有已證明的安全記錄，或已獲得FDA批準。例如，用于術(shù)中檢測腫瘤邊緣的成像探針中使用的蛋白酶激活底物。同樣，對于基因編碼的合成生物標記物，許多臨床試驗都強調(diào)了減毒細菌作為靶向腫瘤和提供治療的載體的安全性和實用性。這些先例提供了對合成生物標記物實施例的更廣泛理解，這些合成生物標記物將是安全的，并在人類耐受性良好。

展望

盡管合成生物標記物這一新興領(lǐng)域令人興奮且充滿希望，但我們目前對癌癥發(fā)病機制的認識還存在一些空白，需要在應(yīng)對技術(shù)挑戰(zhàn)的同時加以填補，以指導未來的進展。特別是，對早期病變的生物學以及前體病變何時和如何轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤的理解有限，但需要這些信息來指導傳感器工程策略。這突出了合成生物標記物領(lǐng)域?qū)Π┌Y早期檢測的挑戰(zhàn)。

此外，還有許多問題需要回答。例如，對哪些早期腫瘤或癌前病變可以推動傳感器的工程化？機器學習如何支持識別復(fù)雜生物數(shù)據(jù)集中的關(guān)鍵特征，以實現(xiàn)合成生物標記物所需的預(yù)測能力？哪些人群將從早期檢測中受益大？患者多久可以接受一次篩查？在什么情況下可以使用相同的探針檢測癌癥復(fù)發(fā)？與目前的護理標準相比，對“高?！被颊哌M行長期監(jiān)測的成本有多高？如何克服患者和腫瘤的異質(zhì)性以確保診斷的準確性？

盡管目前的未知數(shù)似乎比得到的答案更多，但我們可以相信，通過多學科的努力，以及科學家大膽創(chuàng)新的愿景，解決方案將以越來越快的速度出現(xiàn)。