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分子診斷三大經(jīng)典技術(shù):qPCR、NGS、數(shù)字PCR!

文章來源:醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)發(fā)布日期:2022-05-19瀏覽次數(shù):130
分子診斷是將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于疾病診斷的醫(yī)學(xué)分支學(xué)科,利用分子生物學(xué)技術(shù)研究人體內(nèi)源性或外源性生物分子的存在、結(jié)構(gòu)或表達調(diào)控變化,為疾病的預(yù)防、預(yù)測、診斷、治療、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。醫(yī)療的發(fā)展,將持續(xù)推動分子診斷的進步。目前常見核酸分子診斷技術(shù)涉及三個技術(shù):熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)、高通量測序技術(shù)(NGS)和數(shù)字PCR。如何選擇,我們作一下簡要介紹。
qPCR
在1983年,美國人Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR),這一技術(shù)將DNA的變性原理以及復(fù)性原理加以利用,采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復(fù)性,讓核酸片段實現(xiàn)了體外擴增,可將極微量的目標DNA特異地擴增上百萬倍,從而提高對DNA分子的分析和檢測,因為PCR有著很高的靈敏度以及特異性,而且簡便快速,所以這種技術(shù)已經(jīng)成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度高的技術(shù)。
qPCR通過熒光染料或熒光特異性探針,對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤,實時監(jiān)控反應(yīng)過程。每擴增一條DNA鏈,就有熒光染料分子結(jié)合到雙鏈DNA上或有熒光分子從探針上釋放,實現(xiàn)熒光信號的累積。由于熒光積累與PCR產(chǎn)物形成完全同步,可通過軟件對熒光積累信息進行分析和計算,獲得待測樣品模板的初始濃度。但是,qPCR只能夠通過標準曲線和標準品進行相對定量,無法做到定量。

NGS

基因測序是直接獲得核酸序列信息的技術(shù)手段,是分子診斷技術(shù)的一項重要分支。雖然分子雜交、分子構(gòu)象變異或定量PCR技術(shù)在近幾年已得到了長足的發(fā)展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設(shè)上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術(shù)上的金標準。
NGS可以一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。在基因組水平上,NGS可進行從頭測序而獲得該物種的全長序列,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ);對已知參考序列的物種,進行全基因組重測序可檢測新的突變位點,發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平上,NGS可進行全轉(zhuǎn)錄組測序,開展可變剪接、基因表達差異、新非編碼RNA分子發(fā)現(xiàn)等研究。
NGS與染色質(zhì)免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)相結(jié)合,可檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。NGS功能強大,適合用于探索篩選新的生物標志物,但是實驗操作較復(fù)雜,數(shù)據(jù)分析難度較大,檢測周期長,成本較高。

數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是新興起來的一種核酸分子定量技術(shù)。該技術(shù)可直接獲得DNA分子的拷貝數(shù),實現(xiàn)起始樣品中核酸分子的定量,且無需標準品或內(nèi)標。數(shù)字PCR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等各個領(lǐng)域,如拷貝數(shù)變異、突變檢測、復(fù)雜來源樣品中低豐度核酸分子檢測、NGS數(shù)據(jù)驗證、miRNA等微小差異表達研究、單細胞基因表達分析等方面,在已知突變的癌癥分子標志物的檢測、傳染病病原體檢測、基因組三倍體分析和基因表達分析等領(lǐng)域展現(xiàn)了強大的優(yōu)勢。

總結(jié)

在實驗過程中,大家會有疑問:選擇哪種檢測技術(shù)才能更好的達到預(yù)期結(jié)果?通過突變檢測限、定量能力、操作簡易程度、檢測費用、適用場所、發(fā)現(xiàn)未知序列等方面進行比較,您或許會有自己的答案。
數(shù)字PCR因為靈敏度高、定量、適合于醫(yī)院操作等優(yōu)點,在腫瘤液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、感染性疾病早期診斷等臨床檢測應(yīng)用方面具有顯著優(yōu)勢。NGS在檢測未知序列、未知突變、高通量多位點檢測方面是更好的選擇,是科研和獨立實驗室服務(wù)的好工具。qPCR適用于較常規(guī)的臨床分子診斷項目。
總的來看,分子診斷技術(shù)的應(yīng)用不僅深化對疾病發(fā)病機制分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究,而且不斷擴大了分子診斷疾病的病種,隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質(zhì)組計劃的啟動,分子診斷方法將極大地推動現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展,并通過這些基本技術(shù)的衍生、聯(lián)合產(chǎn)生新的分析方法,從而提高分子診斷的特異性、敏感性和準確性,為臨床醫(yī)學(xué)診斷和治療提供更準確的數(shù)據(jù)和信息。