癌癥免疫研究的助推器！免疫基因組學(xué)&單細(xì)胞時(shí)代的免疫組學(xué)
文章來(lái)源：賢集網(wǎng)發(fā)布日期：2022-03-26瀏覽次數(shù)：413 在過(guò)去的幾年里，隨著研究人員深入研究腫瘤已經(jīng)對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)發(fā)生了變化。腫瘤的定義也從腫瘤細(xì)胞聚集轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞組成的復(fù)雜器官樣結(jié)構(gòu)。器官內(nèi)的所有結(jié)構(gòu)，包括免疫浸潤(rùn)，血管，細(xì)胞外基質(zhì)等也稱(chēng)為腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）是腫瘤研究的熱門(mén)課題。隨著腫瘤免疫的發(fā)展，TIME在癌變，腫瘤進(jìn)展，轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)和潛在治療靶點(diǎn)中十分重要。TIME組分主要分為免疫細(xì)胞和分泌因子。TIME中包括多種免疫細(xì)胞亞群，如T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞等。其中，T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng)而髓源性抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)抑制抗腫瘤免疫。然而，也有研究表明CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤功能可能會(huì)通過(guò)T細(xì)胞衰竭而受到抑制?？偟膩?lái)說(shuō)，不同免疫細(xì)胞類(lèi)型和特定免疫細(xì)胞類(lèi)型的不同功能狀態(tài)都可能對(duì)抗腫瘤免疫產(chǎn)生不同的作用（圖1）。因此，使用生物信息分析表征腫瘤免疫學(xué)特征并加深研究人員對(duì)腫瘤免疫的理解十分重要。圖1腫瘤免疫微環(huán)境的組分和互作1.NGS時(shí)代的免疫組學(xué)技術(shù)——免疫基因組學(xué)在過(guò)去的20年里，使用WGS，WES和RNA-seq數(shù)據(jù)成功構(gòu)建了人類(lèi)的參考基因組，為癌癥免疫應(yīng)答研究奠定了基礎(chǔ)。與Sanger測(cè)序相比，二代測(cè)序（NGS）可以獲得高通量的基因組學(xué)數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，為研究免疫應(yīng)答提供有價(jià)值的信息。在NGS時(shí)代，免疫基因組學(xué)不僅包括免疫細(xì)胞的全局圖譜，還包括通過(guò)異常肽預(yù)測(cè)，HLA分型和MHC-肽結(jié)合親和力預(yù)測(cè)免疫原蛋白。1.1 TIME的免疫細(xì)胞定量研究腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）由各種免疫細(xì)胞組成。以往的腫瘤免疫細(xì)胞組成研究中，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化（IHC）方法由于成本高和組織可得性低無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模分析?；贜GS技術(shù)，由于細(xì)胞的高度異質(zhì)性不同免疫細(xì)胞類(lèi)型的基因表達(dá)情況差異很大，因此可以使用NGS數(shù)據(jù)評(píng)估不同免疫細(xì)胞類(lèi)型的豐度。接下來(lái)主要討論基于RNA-seq數(shù)據(jù)的方法，分為基因集富集分析（GSEA）和反卷積分析兩種方法（圖2和圖3）。圖2基于NGS數(shù)據(jù)的腫瘤免疫基因組學(xué)計(jì)算工具圖3免疫細(xì)胞定量算法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)基于GSEA的算法包括ESTIMATE，xCell和MCP-counter。ESTIMATE算法使用免疫打分和基質(zhì)打分表示免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的比例分布，但不能區(qū)分特異性免疫細(xì)胞類(lèi)型。xCell基于ssGSEA方法從多個(gè)RNA-seq和芯片數(shù)據(jù)中獲取不同細(xì)胞類(lèi)型的基因集，從而增加模型的魯棒性。xCell可以良好的區(qū)分高度相似的細(xì)胞類(lèi)型。MCP-counter根據(jù)標(biāo)記基因的表達(dá)水平計(jì)算免疫細(xì)胞的豐度打分。基于反卷積的算法包括DeconRNAseq,PERT,CIBERSORT,TIMER,EPIC,quanTIseq和deconf。CIBERSORT是基于反卷積算法常用的工具之一，CIBERSORT利用線性支持向量回歸和基因表達(dá)矩陣表征免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平。QuanTIseq是為RNA-seq數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的，分析流程包括RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)處理，基因表達(dá)量化和基于約束小二乘回歸的反卷積。目前，ESTIMATE,CIBERSORT和MCP-counter是常用的計(jì)算免疫細(xì)胞組分的方法，其中CIBERSORTx適用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。免疫基因組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用評(píng)估特定類(lèi)型癌癥的整體免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平。在多組學(xué)研究中，xCell用于描述腎透明細(xì)胞癌，肺腺癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的免疫細(xì)胞水平。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的33種癌癥類(lèi)型的免疫細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行分析，Thorsson等人將癌癥免疫狀態(tài)分為6個(gè)不同簇并使用CIBERSORT分析這6個(gè)免疫亞型的免疫細(xì)胞組成并比較不同病理特征和治療反應(yīng)的患者的TIME組成。Gil等人使用CIBERSORT揭示乳腺導(dǎo)管原位癌（DCIS）和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（IDCs）的浸潤(rùn)T細(xì)胞亞群的差異。CD8+T細(xì)胞富集與DCIS中而Tregs和CD4+T輔助細(xì)胞富集與IDC中。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)合NGS數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)算法可以區(qū)分免疫細(xì)胞類(lèi)型。然而，免疫細(xì)胞包括不同性質(zhì)和生物學(xué)功能的亞型。因此，單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展可以更加有效的分辨細(xì)胞亞型。1.2鑒定腫瘤抗原基因組水平突變，轉(zhuǎn)錄組水平突變和蛋白水平改變均會(huì)導(dǎo)致異常蛋白的表達(dá)，例如腫瘤抗原。這些蛋白可以被免疫細(xì)胞識(shí)別并觸發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答。其中，病毒抗原，癌癥生殖系統(tǒng)抗原和新抗原均具有較高的腫瘤特異性，目前已成為腫瘤疫苗的主要靶點(diǎn)。因此，作者主要討論這些腫瘤特異性抗原的鑒定。根據(jù)抗原識(shí)別過(guò)程，免疫基因組學(xué)可以通過(guò)計(jì)算分析預(yù)測(cè)異常多肽，進(jìn)行HLA分析，預(yù)測(cè)MHC-多肽結(jié)合親和力（表1）。基于WES,WGS和RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)異常多肽。體細(xì)胞DNA突變主要包括單核苷酸突變（SNVs）和小片段差異缺失（Inde），接下來(lái)主要介紹鑒定DNA突變的工具。GATK是基于WES,WGS和RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定SNV和Indel的金標(biāo)準(zhǔn)，同樣可以用于鑒定CNVs和SV。而對(duì)于低頻突變，LoFreq和MuTect的敏感性和特異性較高。VarScan2和SomaticSniper需要較高的等位基因分?jǐn)?shù)才能保證較高的靈敏度。此外，VarScan，F(xiàn)reeBayes，Samtools，Vardict和EBCall可用于腫瘤抗原鑒定。然而，目前沒(méi)有工具可以較好地處理假陰性和假陽(yáng)性。如何優(yōu)化現(xiàn)有工具，設(shè)計(jì)一個(gè)多功能，高效的突變鑒定工具，以便較好的處理假陰性和假陽(yáng)性是值得研究的問(wèn)題。通過(guò)將VarScan，GATK,Pindel,BreakDancer,Strelka和Genome STRiP集成到一個(gè)Web界面中——GenomeVIP，已應(yīng)用于TCGA等大型項(xiàng)目中。此外，好選擇兩種以上工具來(lái)鑒定突變。HLA分型。異常肽需要結(jié)合HLA來(lái)輔助TCR識(shí)別，從而引起免疫反應(yīng)。HLA基因分為Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)，不同HLA與異常蛋白的結(jié)合親和力不同。因此，預(yù)測(cè)HLA分型對(duì)腫瘤抗原識(shí)別至關(guān)重要。盡管PCR和測(cè)序方法是標(biāo)準(zhǔn)的HLA分型方法，但是其低通量限制其應(yīng)用范圍。HLA-miner和Seq2HLA是早期用于HLA分析的工具。近年來(lái)，PHLAT,HLAreporter,SNP2HLA,HLA-HD,Optitype和HLA-VBSseq等工具在提高HLA分析準(zhǔn)確率和分辨率方面做出了很大努力。其中，Polysolver可以實(shí)現(xiàn)HLA高精度分型，并使用低覆蓋度的WES數(shù)據(jù)。然而，HLA類(lèi)型的復(fù)雜性，仍然需要可以準(zhǔn)確進(jìn)行HLA分型的工具。預(yù)測(cè)抗原-MHC結(jié)合親和力。MHC分子可以分為Ⅰ類(lèi)，Ⅱ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)三種亞型，Ⅰ類(lèi)MHC分子（MHC-Ⅰ）與腫瘤免疫治療有關(guān)，Ⅱ類(lèi)MHC分子（MHC-Ⅱ）與癌癥患者預(yù)后良好有關(guān)而Ⅲ類(lèi)MHC分子（MHC-Ⅲ）在細(xì)胞表面不表達(dá)，因此不做進(jìn)一步討論。與MHC-Ⅱ分子相比，MHC-Ⅰ能夠結(jié)合8-11個(gè)氨基酸的短肽。基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）訓(xùn)練模型和位置特異性打分矩陣（PSSM）開(kāi)發(fā)了NetMHC和NetMHCpan等工具，可以用于預(yù)測(cè)pMHC-Ⅰ的結(jié)合親和能力。僅基于PSSM開(kāi)發(fā)的工具PSSMHCpan同樣可以準(zhǔn)確高效的預(yù)測(cè)pMHC-Ⅰ的結(jié)合親和能力。Li等人通過(guò)訓(xùn)練包括87個(gè)等位基因的數(shù)據(jù)集和獨(dú)立測(cè)試集的結(jié)果表明PSSMHCpan優(yōu)于其他方法，然而需要進(jìn)一步的研究證明其結(jié)果。目前，預(yù)測(cè)pMHC-Ⅰ的結(jié)合親和能力的金標(biāo)準(zhǔn)是NetMHCpan-4.1。pMHC-Ⅱ的形成過(guò)程與pMHC-Ⅰ類(lèi)似，但通常會(huì)結(jié)合更長(zhǎng)的肽段。由于MHC-Ⅱ結(jié)合多肽長(zhǎng)度的多樣性和HLAⅡ類(lèi)多肽結(jié)合位點(diǎn)的開(kāi)放性，使開(kāi)發(fā)預(yù)測(cè)工具具有一定難度。目前已有的工具包括CONSENSUS，ProPred，MixMHC2pred，MHCnuggets，NetMHCII和NetMHCIIpan。Nielsen等人使用Reynisson et.106的數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析表明NetMHCIIpan-4.0優(yōu)于其他方法。盡管這些工具的原理，用法和輸入輸出格式有所不同，但是其靈敏度，準(zhǔn)確性和可用性等方面都不完美。為了更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)腫瘤抗原以協(xié)助后續(xù)疫苗設(shè)計(jì)還需要開(kāi)發(fā)更加準(zhǔn)確的工具。2.單細(xì)胞時(shí)代的免疫組學(xué)盡管NGS技術(shù)對(duì)腫瘤免疫的研究極大的促進(jìn)了腫瘤學(xué)的發(fā)展，但是bulk測(cè)序技術(shù)是從組織或細(xì)胞群中提取RNA和DNA，并得到整體的平均表達(dá)水平。然而，由于腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性和免疫細(xì)胞的多樣性，bulk測(cè)序掩蓋了很多重要的生物學(xué)現(xiàn)象。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使研究水平從組織水平精細(xì)到單細(xì)胞水平（圖4）。圖4單細(xì)胞水平的免疫組學(xué)技術(shù)比較2.1基于單細(xì)胞的腫瘤免疫細(xì)胞研究腫瘤組織作為一個(gè)高度復(fù)雜的組織，其生物學(xué)行為，包括癌變，腫瘤進(jìn)展，轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)和治療反應(yīng)都依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞與周?chē)?xì)胞的互作。因此，確定TIME特征和細(xì)胞組分對(duì)腫瘤免疫研究十分重要。2.1.1基于蛋白質(zhì)的單細(xì)胞分析流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是利用熒光染料偶聯(lián)抗體識(shí)別和量化細(xì)胞類(lèi)型，流式細(xì)胞技術(shù)在研究腫瘤免疫細(xì)胞，區(qū)分不同免疫細(xì)胞亞群方面發(fā)揮重要作用。常規(guī)的流式細(xì)胞儀是8參數(shù)流式細(xì)胞儀，隨著技術(shù)的進(jìn)步，還開(kāi)發(fā)了30和50參數(shù)的流式細(xì)胞儀。多參數(shù)流式細(xì)胞儀可以從用一樣本中獲得更多的信息。目前，已開(kāi)發(fā)了很多工具用于數(shù)據(jù)預(yù)處理，細(xì)胞亞群識(shí)別，聚類(lèi)和可視化等。然而，盡管流式細(xì)胞儀可設(shè)置的參數(shù)變多但是精度卻沒(méi)有提高，這一缺點(diǎn)在一定程度上限制了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用和發(fā)展。質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)。質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)又稱(chēng)為飛行時(shí)間流式細(xì)胞技術(shù)（CyTOF）是該領(lǐng)域的新技術(shù)，他將流式細(xì)胞技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合。與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞技術(shù)相比，該方法使用金屬同位數(shù)標(biāo)記抗體并使用飛行時(shí)間探測(cè)器對(duì)信號(hào)量化。CyTOF可以對(duì)腫瘤組織繪制免疫細(xì)胞圖譜并鑒定生物標(biāo)記物。Chevrier等人使用質(zhì)譜細(xì)胞技術(shù)繪制腎透明細(xì)胞癌TIME圖譜和與臨床特征相關(guān)的免疫組分。Friebel等人發(fā)現(xiàn)大腦對(duì)癌癥的免疫反應(yīng)是由癌癥類(lèi)型決定的，使用CyTOF可以根據(jù)組織和侵入性免疫細(xì)胞的異質(zhì)性組成對(duì)原發(fā)性腦腫瘤和腦轉(zhuǎn)移患者的TIME進(jìn)行定位和分析。光譜流式細(xì)胞技術(shù)。光譜流式細(xì)胞技術(shù)是使用熒光染料標(biāo)記抗體并使用色散光學(xué)和新型探測(cè)器代替經(jīng)典光學(xué)和常規(guī)探測(cè)器。隨著技術(shù)的發(fā)展，光譜流式細(xì)胞技術(shù)可能會(huì)取代多色流式細(xì)胞技術(shù)。流式細(xì)胞技術(shù)，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)和光譜流式細(xì)胞技術(shù)都是基于特定標(biāo)簽與相應(yīng)細(xì)胞亞群結(jié)合并識(shí)別標(biāo)簽，因此在收集樣本前必須確定相應(yīng)靶點(diǎn)。由于這一原因可能會(huì)降低結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，成本，速度和可操作性都應(yīng)該是需要考慮的問(wèn)題。2.1.2單細(xì)胞RNA測(cè)序單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使研究水平細(xì)化到單細(xì)胞水平?；贜GS，單細(xì)胞測(cè)序可以分為單細(xì)胞分離和單細(xì)胞分析兩步。單細(xì)胞分離包括FACS，激光顯微切割，手動(dòng)細(xì)胞挑選，隨機(jī)稀釋和微流控芯片等。單細(xì)胞分析包括單細(xì)胞基因組學(xué)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和單細(xì)胞代謝組學(xué)。目前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用范圍較為廣泛且相對(duì)成熟。Zeisel等人使用scRNA-seq揭示小鼠皮層和海馬體中的細(xì)胞類(lèi)型。Tirosh等人使用scRNA-seq揭示轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的細(xì)胞亞群，為靶向治療和免疫治療提供有價(jià)值的信息。此外，將單細(xì)胞DNA和RNA測(cè)序相結(jié)合描繪了TNBC患者的化療抗性的進(jìn)化軌跡，為治療提供有價(jià)值的信息。單細(xì)胞測(cè)序主要分為單細(xì)胞樣本制備，全基因組或轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，文庫(kù)制備，測(cè)序和數(shù)據(jù)分析等5個(gè)步驟。2.1.3用于鑒定TIME空間結(jié)構(gòu)的方法越來(lái)越多的研究表明TIME的組成和空間結(jié)構(gòu)都會(huì)顯著影響抗腫瘤免疫。然而，上述介紹的單細(xì)胞技術(shù)不能應(yīng)用于研究TIME的空間結(jié)構(gòu)。因此，接下來(lái)按照發(fā)展階段簡(jiǎn)單介紹幾種可以應(yīng)用于研究單細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)的技術(shù)（圖5）。圖5單細(xì)胞空間技術(shù)的發(fā)展初始階段：HE染色。在初始階段使用HE染色的腫瘤樣本載玻片的組織成分進(jìn)行顯微鏡分析，研究人員可以區(qū)分嗜堿細(xì)胞核和嗜酸細(xì)胞質(zhì)，從而提空空間結(jié)構(gòu)圖像。然而，在沒(méi)有特定標(biāo)記的情況下，研究人員只能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將細(xì)胞劃分為幾大細(xì)胞亞群并不適合表征TIME的空間結(jié)構(gòu)。發(fā)展階段：mIHC&mIF。免疫標(biāo)記的發(fā)展顯著改變了TIME空間結(jié)構(gòu)的方法。IHC和IF利用特定細(xì)胞中抗原的熒光染料或酶標(biāo)抗體來(lái)細(xì)分細(xì)胞類(lèi)型。多重免疫組織化學(xué)/免疫熒光（mIHC/IF）能夠同時(shí)檢測(cè)單個(gè)切片上的多個(gè)標(biāo)記，從而提高研究人員對(duì)TIME空間結(jié)構(gòu)的了解。成熟階段：CODEX,IMC和MIBI-TOF。CODEX是一種多路細(xì)胞計(jì)數(shù)成像方法，利用包含獨(dú)特寡核苷酸序列涉及特定barcode代替熒光染料或酶標(biāo)基因。CODEX的準(zhǔn)確度高于mIHC/IF。Goltsev等人使用CODEX在患有系統(tǒng)性自身免疫性疾病的冷凍動(dòng)物脾組織中觀察到脾細(xì)胞互作動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。多重熒光顯微鏡法（MxIF）和多表位配體制圖（MELC）可以在單樣本中檢測(cè)多100種抗原。MxIF優(yōu)于MELC，它可以定量FFPE組織中多種分析物，單細(xì)胞和亞細(xì)胞表征并將組織學(xué)染色與DNA熒光原位雜交（FISH）相結(jié)合。成像質(zhì)譜儀（IMC）是質(zhì)譜儀的一種擴(kuò)展，類(lèi)似于IHC和質(zhì)譜儀相結(jié)合。IMC用激光激活產(chǎn)生粒子，通過(guò)氣體將粒子帶到質(zhì)譜流式細(xì)胞儀并在載玻片上生成高分辨率圖像。IMC保留了抗原特異性并同時(shí)提供了32種蛋白質(zhì)的空間分辨率。此外，基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）質(zhì)譜流式細(xì)胞儀可以直接識(shí)別蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝物和藥物的分布，準(zhǔn)確性和靈敏度更高。成熟后階段：空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)。隨著測(cè)序規(guī)模和樣本數(shù)量的增加以及成本的降低，后基因組時(shí)代開(kāi)啟。如何將高分辨率空間信息和單細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)以及將單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)表征空間結(jié)構(gòu)一直是一個(gè)難題?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)的出現(xiàn)就解決了這一難題。類(lèi)似于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，slide-seq和高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組（HDST），利用載玻片上的單層空間barcode珠子捕獲組織中釋放的mRNA。ZipSeq可以使用特定模式照明和光籠寡核苷酸將DNA編碼標(biāo)記到完整組織的活細(xì)胞上，為后續(xù)單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)記錄細(xì)胞位置信息。將scRNA-seq數(shù)據(jù)和原位雜交模式作為輸入，Seurat可以推斷單細(xì)胞的原始空間位置。R包Seurat可以準(zhǔn)確定位細(xì)胞亞群并以應(yīng)用與斑馬魚(yú)中。Andersson等人基于概率模型方法，該方法對(duì)表達(dá)譜反卷積以整合scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并在空間上映射細(xì)胞類(lèi)型。單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)正在快速發(fā)展，但是大多數(shù)方法并沒(méi)有在單細(xì)胞水平研究空間結(jié)構(gòu)，這些技術(shù)仍然是對(duì)較小的細(xì)胞混合物進(jìn)行批量分析。因此，今后的研究仍然致力于開(kāi)發(fā)更多的單細(xì)胞技術(shù)和相關(guān)的測(cè)試研究。3.免疫組學(xué)和AI隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，人工智能已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究人員將機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)應(yīng)用于疾病診斷，預(yù)后和治療反應(yīng)預(yù)測(cè)等方面。在腫瘤免疫方面，人功能呢可以輔助臨床醫(yī)生更好的分析與TIME有關(guān)的腫瘤免疫學(xué)特征和對(duì)免疫治療的反應(yīng)。人工智能在癌癥免疫研究中的應(yīng)用主要分為以下幾個(gè)方面：識(shí)別病理切片；識(shí)別免疫細(xì)胞亞群和空間結(jié)構(gòu)；預(yù)測(cè)患者TIME的特征和對(duì)免疫治療反應(yīng)。3.1使用深度學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)腫瘤抗原準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腫瘤抗原對(duì)研究和開(kāi)發(fā)個(gè)性化腫瘤疫苗十分重要。然而假陽(yáng)性較高是一個(gè)比較重要的問(wèn)題。目前，預(yù)測(cè)抗原呈遞的工具大多是通過(guò)體外結(jié)合親和力數(shù)據(jù)訓(xùn)練的，而忽略了基因表達(dá)和抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。預(yù)測(cè)腫瘤抗原的第一步是預(yù)測(cè)異常肽，除了已有的識(shí)別SNV的多種算法外，近開(kāi)發(fā)的CN-learn工具可以識(shí)別CNV且性能較好。Bulik等人使用來(lái)自各個(gè)癌癥類(lèi)型的HLA類(lèi)型和HLA肽訓(xùn)練了深度學(xué)習(xí)模型EDGE，可用于NSCLC患者的HLA分型?；谏疃葘W(xué)習(xí)的方法MARIA和MixMHC2pred可以提高M(jìn)HC-Ⅱ的預(yù)測(cè)精度。3.2腫瘤免疫中的放射組學(xué)隨著人工智能在醫(yī)學(xué)影像學(xué)中的發(fā)展，影像學(xué)已經(jīng)不是簡(jiǎn)單的而是海量的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。從感興趣區(qū)域（ROI）中提取和定量和定性特征表征腫瘤生物學(xué)行為并且可以與臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)。這種使用人工智能技術(shù)分析成像數(shù)據(jù)的過(guò)程就是放射組學(xué)。腫瘤免疫的放射組學(xué)技術(shù)主要用于識(shí)別反應(yīng)免疫浸潤(rùn)的生物標(biāo)志物并預(yù)測(cè)ICB治療患者的治療反應(yīng)（圖6）。圖6放射組學(xué)和腫瘤免疫的計(jì)算病理學(xué)首先，放射組學(xué)提供了一種評(píng)估免疫相關(guān)生物標(biāo)志物的方法。例如，使用深度學(xué)習(xí)和FDG-PET預(yù)測(cè)溶細(xì)胞活性打分（CytAct），使用放射組學(xué)預(yù)測(cè)胃癌免疫打分。基于腫瘤突變負(fù)荷放射組學(xué)標(biāo)志物（TMBRB）可以將NSCLC患者分為不同臨床結(jié)局和不同TMB分組，且優(yōu)于其他臨床模型。其次，MOSCATO使用患者的圖像相關(guān)特征和RNA-seq數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，其中使用的放射組學(xué)特征是預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)和總生存期。在ICB管理中，有一些非常規(guī)反應(yīng)。其中一種是超進(jìn)展（HP），代表開(kāi)始免疫治療后的意外加速進(jìn)展。由于其預(yù)后不良，急需預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。另一種是假性進(jìn)展，為開(kāi)始治療后腫瘤大小增加和新病變產(chǎn)生。目前，可以通過(guò)單獨(dú)或組合血液，體積和放射組學(xué)模型，結(jié)合血液生物標(biāo)志物L(fēng)DH和放射組學(xué)方法預(yù)測(cè)假性進(jìn)展。總的來(lái)說(shuō)，放射組學(xué)可以在早期階段識(shí)別腫瘤的變化，對(duì)患者對(duì)免疫治療敏感性進(jìn)行分層并通過(guò)非侵入性方法預(yù)測(cè)其臨床結(jié)果。然而，目前的研究都是回顧性研究，還需要大量的數(shù)據(jù)和前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證。3.3腫瘤免疫的計(jì)算病理學(xué)與放射組學(xué)相比，病理學(xué)主要從更加微觀的角度識(shí)別組織學(xué)的改變。HE染色，IHC和IF輔助病理學(xué)家區(qū)分不同的細(xì)胞亞群。病理學(xué)的人工智能即數(shù)字病理學(xué)，通過(guò)計(jì)算分析探索免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的互作和癌癥生物學(xué)關(guān)鍵行為之間的聯(lián)系提供新的見(jiàn)解。基于CNN的深度學(xué)習(xí)模型可以研究HE染色和IHC染色載玻片上腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平和空間分布。AbdulJabbar等人開(kāi)發(fā)了深度學(xué)習(xí)框架描述TIME的空間結(jié)構(gòu)，揭示同一患者的不同樣本中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)異質(zhì)性。此外，進(jìn)化模式，克隆新抗原和抗原呈遞與TIL分布與TIME的空間復(fù)雜性有關(guān)。結(jié)合免疫細(xì)胞組成和空間組織的預(yù)測(cè)模型與癌癥預(yù)后有關(guān)（圖3）。與放射組學(xué)類(lèi)似，數(shù)字病理學(xué)與深度學(xué)習(xí)結(jié)合可以從圖像中挖掘有價(jià)值的信息。然而數(shù)字病理學(xué)可以從細(xì)胞或分子水平了解TIME。與高維成像技術(shù)IMC和MIBI-TOF一致，數(shù)字病理學(xué)可以作為一種研究TIME結(jié)合和癌癥生物學(xué)與治療反應(yīng)的相關(guān)性的有價(jià)值的方法。數(shù)字病理學(xué)主要采用深度學(xué)習(xí)方法來(lái)解析空間架構(gòu)，可以提供更詳細(xì)的免疫信息。因此放射組學(xué)和數(shù)字病理學(xué)對(duì)免疫微環(huán)境研究十分重要。4.結(jié)論和未來(lái)方向隨著免疫組學(xué)領(lǐng)域新興技術(shù)的發(fā)展，研究人員可以深度剖析腫瘤免疫（圖7）。本篇文章作者展示了腫瘤免疫學(xué)中傳統(tǒng)和先進(jìn)的技術(shù)以及臨床應(yīng)用的前景。圖7免疫組學(xué)藍(lán)圖：發(fā)展趨勢(shì)和未來(lái)方向在bulk測(cè)序時(shí)代，評(píng)估腫瘤免疫細(xì)胞的方法主要包括CIBERSORT和MCP-counter可以輔助研究腫瘤免疫細(xì)胞的個(gè)體浸潤(rùn)模式。此外，預(yù)測(cè)異常肽，HLA分型和預(yù)測(cè)腫瘤抗原-MHC結(jié)合親和力已經(jīng)應(yīng)用于臨床研究中。由于免疫細(xì)胞亞型和ITH的高度多樣性，單細(xì)胞水平上研究腫瘤免疫十分重要。隨著單細(xì)胞免疫相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，從流式細(xì)胞儀和光譜流式細(xì)胞儀到CyTOF，單細(xì)胞腫瘤免疫圖譜有助于免疫細(xì)胞亞群分類(lèi)。在空間結(jié)構(gòu)研究中，HE，IHC/IF，MIBI/TOF和空間分辨率轉(zhuǎn)錄組可以提高TIME的分辨率。人工智能的出現(xiàn)為免疫組學(xué)提供了新的方向。放射組學(xué)和病理學(xué)圖像數(shù)據(jù)結(jié)合深度學(xué)習(xí)深入研究TIME可以為預(yù)測(cè)預(yù)后和免疫治療反應(yīng)提供了臨床信息。隨著免疫組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，還需要考慮以下幾個(gè)問(wèn)題。第一，盡管已經(jīng)有了許多用于質(zhì)控和數(shù)據(jù)分析的方法，但是這些方法的效果還有進(jìn)一步改進(jìn)的空間。第二，期望出現(xiàn)成本低，經(jīng)濟(jì)高效和自動(dòng)化的技術(shù)。第三，期望研究人員充分利用現(xiàn)有技術(shù)研究中路免疫并促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化。第四，期望開(kāi)發(fā)針對(duì)特定癌癥類(lèi)型的技術(shù)。盡管還有很多工作需要進(jìn)行，但是免疫組學(xué)在未來(lái)的腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域?qū)⒄贾鲗?dǎo)地位，其臨床價(jià)值會(huì)極大的推動(dòng)免疫組學(xué)在免疫基因組學(xué)，單細(xì)胞和人工智能領(lǐng)域的發(fā)展。 
