聚肌胞對(duì)人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞TLR3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

作者：王菊1,鐘剛2　　作者單位：1 518106 廣東深圳，深圳市光明新區(qū)公明人民醫(yī)院婦科　2 廣東深圳，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院
　　【摘要】目的 通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究Toll樣受體3(TLR3)在人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1的表達(dá)及聚肌胞PolyI:C對(duì)TLR3 mRNA和蛋白的調(diào)節(jié)作用。方法 體外培養(yǎng)TEV-1細(xì)胞;用不同時(shí)間及濃度聚肌胞刺激TEV-1細(xì)胞后RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)其TLR3 mRNA和蛋白的表達(dá)變化;免疫細(xì)胞化學(xué)SP染色法檢測(cè)TLR3蛋白的定位表達(dá)。結(jié)果 (1)PolyI:C 刺激可上調(diào)TEV-1細(xì)胞株TLR3 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，且與刺激時(shí)間和劑量呈正相關(guān)。(2) PolyI:C 刺激可上調(diào)TEV-1細(xì)胞株TLR3蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(P<0.01);但熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)刺激12h與刺激前比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);刺激24h、48h的熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與刺激時(shí)間和劑量呈正關(guān)(24h P<0.05;48h P<0.01)。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)顯示TLR3主要定位于TEV-1細(xì)胞株的細(xì)胞漿。結(jié)論 TEV-1細(xì)胞株TLR3的mRNA及蛋白的表達(dá)與Poly(I:C) 刺激時(shí)間及劑量呈正相關(guān);TLR3主要定位于TEV-1細(xì)胞株的細(xì)胞漿，而細(xì)胞核及細(xì)胞膜沒(méi)有觀測(cè)到明顯表達(dá)。提示人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞可能通過(guò)細(xì)胞漿的TLR3參與早孕母-胎界面的免疫反應(yīng)。
　　【關(guān)鍵詞】 TLR3;Poly(I:C);TEV-1細(xì)胞株;流式細(xì)胞儀;平均熒光強(qiáng)度;熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);免疫細(xì)胞化學(xué)

　　[Abstract] ob[x]jective To investigate the regulatory effect of PolyI:C on the ex[x]pression of TLR3 mRNA and protein in the human extravillous trophoblast cell line (TEV-1)，and whether the regulatory effect depends on PolyI:C’s dose and time.Methods Semi-quantitative RT-PCR analysis，flow cytometry and immuo-cytochemistry were used to dedect TLR3 mRNA and protein ex[x]pression level and location in TEV-I cell line.Results (1)The ex[x]pression of TLR3 mRNA in TEV-I cell line significantly increased with the PolyI:C’s stimulation time and dose increase; compare to without PolyI:C’s stimulation(P<0.01).The mean fluorescence intensity of the TLR3 protein in TEV-I cell line increased with the PolyI:C’s stimulation time and dose increase; compare to without PolyI:C’s stimulation(P<0.01).(2)The number of fluorescence positive cell of the TLR3 protein stimulated 12 hour had no statistics significance(P>0.05); But its increased with the stimulation time and dose increase in 24 and 48 hour intervention(24h P<0.05 ; 48h P<0.01).(3)The Immuocytochemistry result revealed that TLR3 protein was expressed in TEV-I cell line’s cytoplasma.However，it’s hardly to see the ex[x]pression in the cellular membrane and nucleus.Conclusion TLR3 protein was expressed in TEV-I cell line and localized to the cytoplasma.The increase of mRNA and protein ex[x]pression of TLR3 in TEV-I cell line depends on the increase of the dose and time for PolyI:C’s stimulation.

　　[Key words] TLR3，PolyI:C;TEV-I cell line; flow cytometry; average fluorescence intensity; the number of fluorescence positive cell

　　正常妊娠時(shí)母-胎界面存在著很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，其主要作用是促進(jìn)胚胎植入和調(diào)節(jié)胎盤的發(fā)育，使母體對(duì)半異體來(lái)源的胎兒、胎盤產(chǎn)生耐受;同時(shí)，維持宿主防御反應(yīng)，從而阻止病原微生物對(duì)機(jī)體組織和妊娠的破壞。母胎界面處的滋養(yǎng)細(xì)胞、免疫活性細(xì)胞及細(xì)胞因子，構(gòu)成了母-胎界面的免疫微環(huán)境，對(duì)于妊娠的建立、維持、胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育以及分娩發(fā)動(dòng)起著重要作用[1]。而妊娠病理(如:反復(fù)自發(fā)性流產(chǎn)、早產(chǎn)、子癇、胎膜早破、IUGR等)則與母-胎界面的免疫微環(huán)境的改變有關(guān)[2]。因此，母-胎界面處細(xì)胞生物學(xué)和分子免疫學(xué)的研究已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　天然免疫性細(xì)胞是可以通過(guò)對(duì)病原體表達(dá)的病原體相關(guān)分子模式識(shí)別各種病原體的。Toll樣受體是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的重要的免疫受體，它在天然免疫中通過(guò)對(duì)病原體相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的識(shí)別發(fā)揮作用，通過(guò)刺激信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生和協(xié)同刺激因子的表達(dá)，從而在天然免疫和獲得性免疫中起到了橋梁的作用[3]。近年來(lái)的研究進(jìn)展還發(fā)現(xiàn)Toll樣受體也廣泛表達(dá)于女性生殖系統(tǒng)及母-胎界面，在局部抗感染、生殖免疫、妊娠免疫的生理及病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4，5]。本研究采用RT-PCR、流式細(xì)胞儀檢測(cè)及免疫細(xì)胞化學(xué)SP法染色法測(cè)定Toll樣受體3(TLR3)蛋白在人早孕絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞株(TEV-1)的定位及基因、蛋白表達(dá)和聚肌胞對(duì)其表達(dá)的影響，從而探討TLR3在母-胎界面的表達(dá)及免疫作用。
　　1 材料與方法
　　1.1 細(xì)胞株來(lái)源 人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1由香港大學(xué)饋贈(zèng)。
　　1.2 試劑

　　單克隆小鼠抗人TLR3一抗：美國(guó)Santa Cruz 生物技術(shù)公司;羊抗小鼠IgG熒光二抗(FITC標(biāo)記)：購(gòu)自美國(guó)KPL生物技術(shù)公司;引物：由上海博亞公司合成;Poly(I:C)：美國(guó)Sigma生物技術(shù)公司。
　　1.3 方法

　　1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

　　TEV-1細(xì)胞株接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用DMEM/F12培養(yǎng)液及10%胎牛血清的混合液4～5ml在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待80%融合后，吸掉舊培養(yǎng)基，D-Hanks液洗滌細(xì)胞1次，0.25%胰蛋白酶消化1～2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將分離而呈圓粒狀時(shí)，立即加入適量含血清的新鮮培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用。再用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁使細(xì)胞脫落，并把細(xì)胞吹散至均勻。然后依1：3的比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以上述條件培養(yǎng)。
　　1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR3蛋白在TEV-1細(xì)胞株的表達(dá)

　　將TEV-1細(xì)胞株種植于7個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%融合后換成1ml的optin -MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。6個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入poly(I:C)12μg、25μg及分別培養(yǎng)12、24、48h，另一培養(yǎng)皿則不加。然后制成細(xì)胞懸液，無(wú)水乙醇固定，加入50μl 0.2% TritonX100破膜，PBS洗2次。加BSA稀釋的單克隆小鼠抗人TLR3一抗100μl，4℃過(guò)夜，PBS洗2次。加BSA稀釋的羊抗小鼠IgG熒光二抗(FITC標(biāo)記)100μl，4℃孵育30min，PBS洗2次,標(biāo)本置流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。
　　1.3.3 RT-PCR

　　1.3.3.1 RNA的提取
　　參照TRIZOL試劑盒(美國(guó)GIBCOBRL公司)說(shuō)明書進(jìn)行提取RNA。
　　1.3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成

　　將RNA稀釋為1μg/μl，取2μl RNA加入1μl Oligo (dT)15 (0.5μg/μl)、DEPC-H2O 7μl，充分混勻后，離心，在70℃孵育5min，迅速置于冰上，3min后離心;加入5×Reaction Buffer 4μl，dNTP Mix(10mmol/L)1μl，M-MLV Reverse Transc[x]riptase(Promega公司，200U/μl)1μl，DEPC-H2O 4μl;42℃孵育60min;95℃孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性，然后置4℃以備作PCR用。
　　1.3.3.3 引物設(shè)計(jì) 見表1。表1 β-actin和TLR3引物序列

　　1.3.3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 擴(kuò)增體系：10×Taq Buffer 5μl，MgCl2(25mmol/L) 3μl，dNTP Mix(10mmol/L)1μl，引物各(10μmol/L)1μl，cDNA 2μl，Taq 聚合酶(1U/μl)1μl，DEPC-H2O 36μl ;95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，54.4℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10min。
　　1.3.3.5 瓊脂糖凝膠電泳 75V電壓下2%瓊脂糖凝膠電泳40min，紫外燈下觀察條帶。
　　1.3.3.6 采用英國(guó)UVP公司GDS-8000型全自動(dòng)凝膠成像分析儀掃描DNA條帶灰度值，用軟件分析條帶灰度比值。
　　1.3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)SP法染色 將蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿，將TEV-1細(xì)胞株接種于其中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞爬片;取出細(xì)胞爬片冰丙酮固定20min，細(xì)胞面向上固定于載玻片上;3%H2O2 封閉內(nèi)源性酶;5%的正常山羊血清封閉;以 1：100濃度稀釋的單克隆鼠抗人TLR3一抗?jié)窈袃?nèi)4℃孵育過(guò)夜;蘇木素復(fù)染后脫水、透明、中性樹膠封片。HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)拍照。
　　1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示,用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。
　　2 結(jié)果

　　2.1 TLR3 mRNA的表達(dá)及變化 TLR3 mRNA的表達(dá)隨刺激時(shí)間及劑量的梯度的上升而增加，與刺激前比較，P<0.01(見圖1、表2)。1泳道為刺激前結(jié)果;2泳道為12μg、12h結(jié)果;3泳道為25μg、12h結(jié)果;4泳道為12μg、24h結(jié)果;5泳道為25μg、24h結(jié)果;6泳道為12μg、48h結(jié)果;　　7泳道為25μg、48h結(jié)果;M為Marker;530bp為β-actin擴(kuò)增片段;334bp為TLR3擴(kuò)增片段圖1 TLR3的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果表2 不同劑量及時(shí)間梯度Poly(I:C)刺激TLR3 mRNA在TEV-1細(xì)胞株的表達(dá)

　　2.2 TLR3蛋白的表達(dá)及變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR3蛋白的表達(dá)，平均熒光強(qiáng)度隨刺激時(shí)間及劑量的增加而上升，與刺激前比較P< 0.01(見表3); 而熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)刺激12h與刺激前比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);刺激24h、48h隨刺激時(shí)間及劑量的增加而上升，P<0.05或<0.01(見表4)。表3 平均熒光強(qiáng)度 表4 熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

　　2.3 TLR3蛋白在免疫細(xì)胞化學(xué)的定位 免疫細(xì)胞化學(xué)(SP染色法)顯示TLR3定位于TEV-1細(xì)胞株的細(xì)胞漿(如圖2)。圖2 TEV-1細(xì)胞株的細(xì)胞漿中可見到清晰的棕黃色顆粒，而細(xì)胞核及細(xì)胞膜則很難看見
　　3 討論

　　近年來(lái)Toll樣受體在母-胎界面的表達(dá)及免疫功能研究備受關(guān)注。研究表明，TLR1-10的mRNA及蛋白在滋養(yǎng)細(xì)胞和晚孕胎盤中都有表達(dá)，同時(shí)其相關(guān)分子和共受體CD14、MD2、MyD88也有表達(dá)。Toll樣受體通過(guò)識(shí)別配體，從而產(chǎn)生效應(yīng)，其中TLR3識(shí)別的配體是病毒雙鏈RNA。目前有關(guān)TLR3在妊娠中的研究有：(1)國(guó)內(nèi)外許多試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射大劑量PolyI:C的小鼠流產(chǎn)率和胚胎吸收率增加，滋養(yǎng)細(xì)胞的TLR3被配體PolyI:C激活后，細(xì)胞內(nèi)IL-2增加，IL-10減少;而且巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞毒性增加。普遍認(rèn)為，IL-10是維持妊娠的重要因子，而IL-2是已知的致流產(chǎn)劑。(2)Masuhiro和Shinsaku[6]檢測(cè)了10種人類TLR和21種TLR相關(guān)基因分布情況，發(fā)現(xiàn)絨毛及胎盤組織中，TLR3水平居于高(以早孕滋養(yǎng)細(xì)胞突出)，該研究采用組織提取RNA方法，對(duì)胎盤TLR3細(xì)胞定位未能提供進(jìn)一步研究。
　　本試驗(yàn)進(jìn)行了Toll樣受體其中之一TLR3在母-胎界面的重要細(xì)胞人早孕絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞株的表達(dá)及影響的研究。檢測(cè)了人早孕絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞株TLR3 mRNA及蛋白的表達(dá)，并且通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)顯示了TLR3蛋白定位(細(xì)胞漿);還檢測(cè)了Poly(I:C) (聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸;簡(jiǎn)稱聚肌胞，是一種人工合成的雙鏈RNA)刺激后TLR3 mRNA及蛋白的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。TLR3 mRNA的表達(dá)隨刺激時(shí)間及劑量的梯度的上升而增加，與刺激前比較差異有顯著性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR3蛋白的表達(dá)，平均熒光強(qiáng)度隨刺激時(shí)間及劑量的梯度的上升而增加，與刺激前比較差異有顯著性;而熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)刺激12h與刺激前比較差異無(wú)顯著性;刺激24h、48h隨刺激時(shí)間及劑量梯度的上升而增加，差異有顯著性。說(shuō)明了TEV-1 細(xì)胞株TLR3的mRNA及蛋白的表達(dá)與Poly(I:C)刺激時(shí)間及劑量呈正相關(guān)。但是熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)刺激12h與刺激前比較差異無(wú)顯著性，說(shuō)明不同水平檢測(cè)TLR3表達(dá)的靈敏度不同，或者可能是蛋白的表達(dá)滯后于mRNA的表達(dá)造成的。
　　母-胎界面的Toll樣受體被激活后，通過(guò)MyD88依賴或非依賴途徑及核轉(zhuǎn)錄因子κB、JNK 等多條信號(hào)途徑活化細(xì)胞，從而產(chǎn)生多種細(xì)胞因子及炎性趨化因子[7]：如IL-6、IL-8、GRO-a、MCP-1、MCP-1a、RANTES，這些細(xì)胞因子與白細(xì)胞的游走及機(jī)體防御有關(guān)。其中的趨化因子不僅便利了免疫細(xì)胞在蛻膜中的募集來(lái)保護(hù)機(jī)體和正常妊娠(例如:蛻膜中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞可以吞噬凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞)，而且被認(rèn)為為正常的妊娠提供了免疫方面的支持。在胚胎種植期，胚胎附著、粘連所必需的整合素和粘連蛋白可能依賴于Toll樣受體激活后產(chǎn)生的前炎癥因子的分泌[8]。Toll樣受體被激活后，可以直接激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)酶caspase或產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子誘發(fā)細(xì)胞的凋亡。絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡是正常妊娠的生理現(xiàn)象，大量形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)正常妊娠期伴隨著絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡與分化，說(shuō)明其凋亡與胎盤的形成、重塑相關(guān)。凋亡不僅可以去除衰老的合體滋養(yǎng)細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞融合而形成合體滋養(yǎng)細(xì)胞。Toll樣受體不但參與妊娠的生理過(guò)程，也與妊娠病理相關(guān)。很多研究發(fā)現(xiàn)，妊娠相關(guān)疾病，如早產(chǎn)、子癇、IUGR、胎膜早破、反復(fù)自發(fā)性流產(chǎn)都與感染及Toll樣受體誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度凋亡密切相關(guān)。已經(jīng)觀察到，患羊膜炎及早產(chǎn)婦女的滋養(yǎng)細(xì)胞TLR-2或(和)TLR-3表達(dá)增高，而子癇前期患者的滋養(yǎng)細(xì)胞TLR-4表達(dá)增高。在妊娠相關(guān)疾病病例中，蛻膜組織中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞顯著增高，而且其分布也發(fā)生改變[9]。這些改變了的免疫細(xì)胞的反應(yīng)可能嚴(yán)重地破壞了正常的妊娠。TLRs可能作為“危險(xiǎn)信號(hào)”與妊娠相關(guān)疾病的橋梁，誘發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度凋亡[10]。
　　隨著對(duì)母-胎界面TLRs家族研究的不斷深入，TLRs在妊娠期免疫應(yīng)答中的作用及具體的作用機(jī)制將進(jìn)一步被揭示。而且有望針對(duì)阻斷TLRs信號(hào)通路，如核轉(zhuǎn)錄因子κB通路，而治療妊娠相關(guān)疾病。
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