CD133 陽性肝癌細胞周期分析

　　作者：王吉榮,張峰　　作者單位：江寧區(qū)中醫(yī)院普通外科(南京 江蘇 );南京醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝臟外科(南京 江蘇)

　　【摘要】 目的：免疫磁珠分選法分選肝癌細胞系SMMC7721 中CD133+細胞, 并檢測CD133+和CD133-細胞周期。方法：采用免疫磁珠分選法分選肝癌細胞系SMMC7721 中CD133+和CD133-細胞, 乙醇固定，PI染色，流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期。結(jié)果：CD133+細胞在SMMC7721中所占比例為0.9%, FCM 檢測顯示SMMC7721 細胞株中CD133+細胞周期處于G0/G1 期的比例為85.3%，而CD133-細胞G0/G1 期的比例相對較低，為61.6%，未分選細胞居中，為68.9%。結(jié)論：人肝癌細胞系SMMC7721 中CD133+亞群,比例約為0.9%,且CD133+細胞多處于靜止期,具有一般干細胞的特性。
　　c　　Analiysis of CD133 Pasitive Liver Cancer Cell Cycle　　Wang Jirong,et al　　Nanjing Jiangning District TCM Hospital(211100)　　Abstract：ob[x]jective：To identify CD133 positive cell in liver cancer cell lines SMMC7721 by magnetic cell sorting and analyze the cell cycle. Methods：CD133 positive and negative cells were sorted by magnetic cell sorting .Then the cell cycle was analyzed with PI in fluorescence-activated cell sorter.Results：The SMMC7721 liver cancer cells contained 0.9 % CD133 positive cells.The percentage of G0/G1cells was higher ( 85.3%) in CD133 positive cells than in CD133 negative cells( 61.6%).Conclusion：Liver cancer cell line SMMC7721 contains CD133 positive cells, and CD133 positive cells were quiescent like other stem cells.

　　Key words：CD133;SMMC7721;Cell cycle;Tumow stem cells

　　近年來的腫瘤干細胞學說認為，腫瘤組織中存在極少量的腫瘤干細胞，這些細胞具有無限增生的潛能，在啟動腫瘤形成和生長中起著決定性作用。這一理論在白血病、乳腺癌、腦腫瘤中已得到證實[1-3]。CD133 是近年在干細胞領(lǐng)域研究較為活躍的細胞膜糖蛋白之一，常表達于未成熟的造血干細胞或祖細胞，在腦腫瘤、前列腺癌[4]、黑色素瘤[5]等惡性腫瘤細胞均有表達，被認為是這些腫瘤干細胞的標志之一。近的報道顯示CD133 在肝癌細胞中也有表達，并且發(fā)現(xiàn)CD133+肝癌細胞具有腫瘤干細胞的生物學特性。本文主要研究免疫磁珠分選法分選CD133+肝癌細胞，并進行細胞周期的檢測，探討CD133+細胞的生物學特性。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料

　　人肝癌細胞株SMMC7721 由江蘇省人民醫(yī)院肝臟外科實驗室提供;DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自南京天為生物科技公司;胎牛血清由民海生物工程公司提供;流式細胞儀(美國BD 公司)，超凈工作臺、CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(Jouan 公司)，離心機( HI-TACHI 公司)，37℃恒溫水浴箱(Polysciences 公司);MACS 系統(tǒng)、CD133 分離試劑盒及CD133 抗體購置德國Miltenyi 公司。
　　1.2 細胞培養(yǎng)

　　SMMC7721 細胞生長在含10%熱滅活胎牛牛血清、100u/ ml 青霉素及100ug/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。
　　1.3 CD133 陽性細胞分選
　　取對數(shù)生長期SMMC7721 和Bel-7402 細胞，細胞數(shù)量級達到1×107，PBS 沖洗兩次，胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，計數(shù)，離心(500g/min，10min)，吸除上清，350μL 緩沖液重懸;加入FC 受體100μL、抗CD133 免疫磁珠50μL, 4～8℃孵育10min;3.5mL 緩沖液重懸，離心，吸除上清，400μL 緩沖液重懸細胞，加入100μL 的anti-Biotin MicroBeads，4～8℃孵育15min;加3.5mL 緩沖液后離心，棄上清，將細胞重懸于500μL 緩沖液中，安裝磁珠分選架和MS 柱, 500μL 緩沖液洗柱，待分選細胞上柱，500μL 緩沖液分三次洗柱;將MS 柱移出磁場,加1mL 的緩沖液洗柱，重復洗柱兩次;所得CD133陽性細胞離心(1500r/min，5min)，培養(yǎng)液DMEM 重懸，取部分細胞用流式細胞儀檢測CD133 的表達率。
　　1.4 細胞周期分析

　　取CD133+、CD133-及未分選細胞，制成單細胞懸液，以1200r/min離心10min，棄上清，PBS 洗滌，800 g/L 冰乙醇固定。棄去固定液，用預(yù)冷的PBS 緩沖液漂洗離心，使用10μL RNAseA(10g/L)處理后，加入熒光染料溴化丙錠溶液490μL，避光染色30min 后上流式細胞儀檢測細胞周期。
　　2 結(jié)果

　　2.1 CD133 陽性細胞分選
　　流式細胞儀檢測顯示CD133+細胞在細胞株SMMC7721 中占0.9%，見圖一A。免疫磁珠細胞分選、純化SMMC7721 中CD133+細胞，流式細胞儀檢測其純度分別是89.2%，見圖一B。圖一A、B 顯示免疫磁珠分選前后SMMC7721 細胞株中CD133+ 細胞數(shù)分別占0.9%、9.2%。
　　2.2 細胞周期分布

　　SMMC7721 細胞株中，剛分選的CD133+細胞多數(shù)處于靜止期，G0/G1 期占85.3%;而CD133-細胞增殖期比例相對較高，S/G2/M 期細胞分別占38.4%，未分選細胞中S/G2/M 期細胞比例居中，占31.1%。
　　3 討論

　　腫瘤干細胞學說認為：腫瘤組織中存在一小群細胞而非整個細胞群具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能，在啟動腫瘤形成和生長中起著重要作用，是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的根源, 這類細胞就是腫瘤干細胞。1997 年Bonnet[1]在血液系統(tǒng)腫瘤中首先證實了腫瘤干細胞的存在。近年來，隨著干細胞分化抗原的研究進步、細胞表面特異性標志的確定以及流式細胞儀的廣泛應(yīng)用，實體腫瘤干細胞的相關(guān)研究也得到較大發(fā)展。目前在乳腺癌、腦腫瘤、結(jié)直腸癌中均發(fā)現(xiàn)了具有一定表型的腫瘤干細胞亞群。CD133 是一種相對分子質(zhì)量為120kD，位于細胞膜表面具有5 個跨膜區(qū)的糖蛋白[6]，是干細胞的標志之一。腫瘤干細胞的概念提出后，研究者發(fā)現(xiàn)許多實體腫瘤腫瘤干細胞與CD133 抗原表達有關(guān)。Singh[3]等發(fā)現(xiàn)人腦腫瘤組織中CD133+腫瘤細胞具有較強的增殖和自我更新能力，在裸鼠皮下接種不到100 個細胞就可以形成新的腫瘤，新形成的腫瘤組織中的細胞構(gòu)成和細胞分化狀態(tài)與原發(fā)腫瘤一致，被認為是腦腫瘤起始細胞的特異性標志。此外在腦腫瘤，在前列腺癌[4]和喉癌[7]中，CD133 也被認為是腫瘤干細胞的標志之一。
　　腫瘤干細胞具有和干細胞相似的特性,干細胞是處于相對靜止的一群細胞,具有慢周期的特點,小鼠表皮干細胞池的S-G2/ M 期細胞比例僅是非干細胞池的1/4[8] 。另外,小鼠角膜干細胞,毛囊干細胞也呈現(xiàn)慢周期的特點。干細胞的這種特點雖有利于防止體內(nèi)未成熟細胞的消耗,可能是傳統(tǒng)治療無法殺滅腫瘤干細胞,成為復發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。我們在分離了SMMC7721 細胞的CD133+和CD133-細胞之后，檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，新鮮分選的CD133+細胞中，多數(shù)細胞處于G0/G 期，S-G2 / M 期細胞占CD133+細胞14.7 %，而CD133-細胞中S-G2 / M期細胞占38.4 %，后者約是前者的2.6 倍，說明CD133+細胞也是慢周期細胞，具有干細胞的特征。腫瘤干細胞應(yīng)該比正常干細胞有更強的存活或自我更新的潛能，二者在細胞周期方面的異同鮮見報道，近的研究顯示,腫瘤干細胞和正常干細胞具有共同的自我更新機制，如Bmi-1 和β-catenin 途徑,p16 和p19AFR 部分介導Bmi-1 在干細胞的細胞周期中的作用，CyclinD1 是β-catenin 的靶基因，細胞周期調(diào)控和自我更新機制有一定的聯(lián)系，這方面也是本課題組今后所要研究的方向。