RNA干擾Nucleostemin基因?qū)θ耸彻馨〦ca109細(xì)胞株增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究

作者：鄭學(xué)芝,劉桂蓮,李麗,孫衛(wèi),念紅　　作者單位： 黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院生理教研室,2.生物自保護(hù)研究所

　　【摘要】目的 篩選NS基因特異性siRNA陽(yáng)性細(xì)胞克隆，研究NS基因特異性RNA干擾對(duì)Eca109細(xì)胞株體外增殖能力的影響。方法 用脂質(zhì)體法將NS特異性siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，Zeocin抗生素壓力篩選后用PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆;MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況，RTPCR方法檢測(cè)NS基因表達(dá)量的變化情況。結(jié)果 與對(duì)照組比較，silencer組腫瘤細(xì)胞趨于分化，細(xì)胞增殖抑制率超過(guò)80%(P<0.01)，差異具有顯著性; NS基因表達(dá)量下降。結(jié)論 NS基因特異性RNA干擾抑制人食管癌Eca109細(xì)胞株體外增殖，使NS基因表達(dá)量下降。

　　【關(guān)鍵詞】 Nucleostemin(NS);RNA干擾;食管癌;基因表達(dá);細(xì)胞增殖

　　NS基因是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的學(xué)者M(jìn)ckay and Tsai 2002年新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)核因子[1]，該基因在干細(xì)胞及人類的數(shù)種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐度很高，但在分化的成體組織中，該基因卻不表達(dá)。二位學(xué)者提出干細(xì)胞與癌細(xì)胞均由相同的蛋白質(zhì)-NS來(lái)決定其細(xì)胞自我復(fù)制的能力，NS可能是干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞通過(guò)G2/S檢驗(yàn)點(diǎn)的特異性調(diào)控因子。本文將以人食管癌Eca109細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料探討NS基因特異性RNA干擾對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞株體外增殖能力的影響。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人食管癌Eca109細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞所; 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶為Gibco公司;PCDNA4/CNSsilencer質(zhì)粒[2];MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：Invitrogen公司;RNA、DNA試劑盒;RTPCR試劑盒：TaKaRa公司;引物合成：上海申能博彩生物科技有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及NS基因轉(zhuǎn)染 人食管癌Eca109細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2潮濕空氣的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。脂質(zhì)體法將PCDNA4/CNSsilencer質(zhì)粒及空載體PCDNA4/Cvector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Eca109細(xì)胞，分別命名為silencer組、vector組，未轉(zhuǎn)染的Eca109細(xì)胞記為normal組。轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行Zeocin抗生素篩選;陽(yáng)性細(xì)胞克隆繼續(xù)在含Zeocin抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

　　1.2.2 陽(yáng)性細(xì)胞克隆的鑒定 提取克隆細(xì)胞基因組DNA，以Zeocin基因?yàn)槟康幕颍ㄟ^(guò)PCR方法進(jìn)行細(xì)胞克隆外源基因整合陽(yáng)性鑒定，同時(shí)以normal組腫瘤細(xì)胞作對(duì)照。其引物序列為：上游引物5′atggccaagttgaccagtgc;下游引物為5′tcagtcctgctcctcggcca。 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，然后 94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循環(huán)，后72℃延伸10min;PCR產(chǎn)物大小約370bp。

　　1.2.3 生長(zhǎng)曲線的繪制[3] 將三組細(xì)胞傳到24孔板上(1×104細(xì)胞/孔)，每組18復(fù)孔，分別于24h、48h、72h、96h、120h、144h用計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪出各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

　　1.2.4 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化情況。

　　1.2.5 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率[3] 在96孔培養(yǎng)板上接種三組細(xì)胞，每組24復(fù)孔(1×103細(xì)胞/孔)，分別于24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間段進(jìn)行MTT測(cè)定，以培養(yǎng)液做空白對(duì)照并調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光度值(OD值)，每次每組測(cè)定8復(fù)孔。

　　細(xì)胞增殖抑制率=1-細(xì)胞存活率

　　即細(xì)胞增殖抑制率=(1-silencer組OD值 / Normal組OD值)×

　　1.2.6 各組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)水平檢測(cè) 提取腫瘤細(xì)胞總RNA，用RTPCR方法驗(yàn)證各組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)情況。參照genebank中NS和GAPDH的基因序列及參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物如下:NS基因上游P1：5′atgaaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：5′gctctccaaattctcctttggta;GAPDH上游為P3：5′ggtggacctgacctgccgtctaga，下游P4：5′ttactccttggaggccatgtggg;擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為570bp和280bp，在同一體系內(nèi)反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min， 94℃變性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循環(huán)，后72℃延伸10min。

　　1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5 軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 PCR法鑒定陽(yáng)性細(xì)胞克隆

　　抗Zeocin的細(xì)胞克隆部分PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1;silencer組與vector組皆檢測(cè)到Zeocin基因條帶，而normal組無(wú)，即細(xì)胞克隆外源基因整合陽(yáng)性。

　　1：normal組;2～4：silencer組細(xì)胞克隆;5～7： vector組細(xì)胞克隆;8：DNA marker:λDNA,Hind Ⅲ 食管癌 Eca109陽(yáng)性細(xì)胞克隆PCR鑒定結(jié)果

　　2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

　　各時(shí)間段silencer組細(xì)胞數(shù)目低于對(duì)照vector組(P<0.01)和normal組(P<0.01)，差異具有顯著性;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

　　細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

　　2.3 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

　　silencer組細(xì)胞與對(duì)照vector組和normal組相比體積變小并趨向于均一，多數(shù)細(xì)胞由梭形趨向變圓，核質(zhì)比變小，瘤巨細(xì)胞減少，細(xì)胞趨于分化。

　　2.4 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

　　細(xì)胞培養(yǎng)24h后，silencer組細(xì)胞增殖抑制率分別為normal組(P<0.01)的94%和vector組(P<0.01)的93%;細(xì)胞培養(yǎng)48h后，silencer組細(xì)胞增殖抑制率分別為normal組(P<0.01)的80%和vector組(P<0.01)的78%;細(xì)胞培養(yǎng)72h后，silencer組細(xì)胞增殖抑制率分別為normal組(P<0.01)的88%和vector組(P<0.01)的87%;細(xì)胞增殖曲線。

　　細(xì)胞增殖曲線

　　2.5 各組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)水平

　　silencer組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照vector組和normal組。

　　1～3：silencer組;4～5：vector組;6～7：normal組; 8. DNA marker:λDNA,Hind Ⅲ 各組腫瘤細(xì)胞中NS基因表達(dá)水平RTPCR鑒定

　　3 討論

　　NS基因是一種p53結(jié)合蛋白，主要存在于核仁中，在核質(zhì)中也有低量表達(dá);在干細(xì)胞處于早期多潛能狀態(tài)時(shí)該基因的表達(dá)豐度很高，而在分化開(kāi)始時(shí)，這個(gè)基因的表達(dá)卻突然幾乎完全消失[1]。本室與中科院遺傳發(fā)育研究所合作證實(shí)了多種腫瘤組織中都有NS基因的表達(dá)[5，6]，運(yùn)用siRNA真核表達(dá)載體，使宮頸癌Hella細(xì)胞的增殖被抑制，細(xì)胞內(nèi)NS基因的表達(dá)量下降[7，8]。

　　本實(shí)驗(yàn)將PCDNA4/CNSsilence載體轉(zhuǎn)染人食管癌Eca109細(xì)胞，同步轉(zhuǎn)染PCDNA4/Cvector空載體作對(duì)照。經(jīng)過(guò)Zeocin抗生素壓力篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞克隆，并通過(guò)PCR方法驗(yàn)證克隆細(xì)胞外源基因整合陽(yáng)性。與對(duì)照組vector和normal組比較，silencer組細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)行為發(fā)生了顯著的變化，細(xì)胞增殖明顯變慢，趨向于分化; MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定顯示silencer組細(xì)胞的增殖速率明顯低于兩對(duì)照組;細(xì)胞增殖抑制率大于80%;各組細(xì)胞RTPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示silencer組腫瘤細(xì)胞中NS基因表達(dá)量明顯下降。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們構(gòu)建的針對(duì)NS基因的特異性siRNA的表達(dá)載體PCDNA4/CNSsilencer是成功并有效用的，將其轉(zhuǎn)染入人食管癌細(xì)胞后，通過(guò)RNA干擾機(jī)制使部分NS基因沉默，從而產(chǎn)生了抑制Eca109細(xì)胞分裂、增殖的效應(yīng)。同時(shí)提示調(diào)節(jié)NS基因活性可能對(duì)腫瘤有防治作用， NS基因能夠預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)展趨勢(shì)，有可能成為一種新的腫瘤標(biāo)記物。但是NS蛋白活動(dòng)的精確分子機(jī)制尚不完全清楚，這仍然需要大量的實(shí)驗(yàn)工作去證實(shí)。運(yùn)用RNA干擾技術(shù)對(duì)NS基因進(jìn)行深入研究可能會(huì)揭示或部分揭示干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖之迷，為腫瘤的早期診斷、基因治療和預(yù)后及以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程等提供理論依據(jù)和工作基礎(chǔ)。