三維全息顯微鏡快速鑒別細胞技術(shù)

近幾年三維計算全息顯微鏡的發(fā)展為生物成像研究開辟了新紀元。三維計算全息技術(shù)所包含的數(shù)據(jù)處理使研究者獲得豐富的量化信息，這些信息包含著非介入實時條件下的細胞和微生物結(jié)構(gòu)。
　　數(shù)字全息在很多方面類似經(jīng)典全息照相，不同的地方在采用光電子感應器代替感光膠片。這樣使得數(shù)字全息的數(shù)據(jù)處理可以應用于生物醫(yī)學、公共醫(yī)療和環(huán)境監(jiān)測等許多方面。這項技術(shù)已經(jīng)結(jié)合顯微鏡被廣泛應用到生物樣品的三維可視化成像。
　　全息成像原理是相干光源通過半透明鏡頭時，光束的振幅和相位在光和物質(zhì)相互作用時受到調(diào)制，這種調(diào)制信號使得輸出波前帶有物體全部三維結(jié)構(gòu)信息。
　　使用數(shù)字全息顯微鏡（DHM），我們可以間接記錄物體波前的相位和振幅信息。通過單個全息樣本，數(shù)字重構(gòu)生物樣品不同深度層次的圖像。因此，DHM一般被歸類為三維光學計算顯微鏡。DHM的核心部件是光學干涉儀，用來形成來自細胞和微生物的菲涅爾衍射光和參考光的干涉場。光學干涉場的強度分布用光電成像感應器（如CCD或者CMOS相機）進行數(shù)字化成數(shù)字全息圖，其中的編碼包含著生物樣品的三維結(jié)構(gòu)信息。反向的菲涅爾變換將對全息圖進行解碼并重構(gòu)樣品特有的相位和振幅調(diào)制信息。這樣DHM不需要對樣品掃描就可以擁有激光掃描共聚焦顯微鏡進行三維成像的優(yōu)點。
　　傳統(tǒng)的明視場顯微鏡通過樣品的光學吸收構(gòu)建圖像而丟失相位信息。由于細胞質(zhì)和大部分細胞器的的光學吸收系數(shù)很小，結(jié)果二維的明視場的細胞圖像通常對比度低很難觀察到有用的細節(jié)部分。一個增加半透明細胞的典　型實例就是利用高吸收系數(shù)的染料對細胞進行染色和固定。可惜這種介入過程經(jīng)常終止細胞的生命周期。而細胞生物學家卻需要監(jiān)測活細胞，研究其行為和動力學過程。幸好光學相位對細胞質(zhì)和周圍介質(zhì)之間的折射率變化很敏感。這個特性已經(jīng)被用到傳統(tǒng)的相襯和干涉場顯微成像技術(shù)拍攝高對比度的圖像。可惜這兩個傳統(tǒng)技術(shù)不能提供細胞的厚度信息。雖然相襯顯微鏡和微分干涉（DIC）顯微鏡在過去在細胞定性方面提供可重用應用，但無法進行定量分析也不能進行細胞和微生物的自動鑒別。再者，為了對生物樣品不同層面聚集，相襯和DIC顯微鏡還必須進行

機械掃描。這會增加成像時間并限制細胞實時檢測和時間動態(tài)過程研究。
　　DHM是一種定量相位成像方法，直接和非介入地提供活體細胞的光學厚度和動態(tài)條件。光學厚度跟細胞厚度和通過細胞折射率的三維形態(tài)有關(guān)。這樣結(jié)合計算機算法，DHM就成為非介入三維實時成像和鑒別細胞、微生物的實用技術(shù)。一張全息圖只需要單次曝光就包含樣品三維結(jié)構(gòu)的豐富定量信息，用來鑒別細胞和辨認物體。為了這個目的，我們可以結(jié)合已經(jīng)發(fā)展起來的自動鑒別物體并被應用于醫(yī)學、軍事、機器人等各種工業(yè)的模式鑒別技術(shù)。
　　近，一些研究人員提出使用三維感應和成像系統(tǒng)作為基于細胞三維結(jié)構(gòu)和態(tài)的非介入自動細胞鑒別技術(shù)。生物樣品的實時、自動拍攝、分析和鑒別將有助于疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、和流行性疾病的早期檢測。而傳統(tǒng)的生物表征方法則需要介入、勞動強度高和耗費時間多，要求染色的方法也對細胞造成危害，還不能有效進行大規(guī)模應用。另外，基于二維特性如樣品的形狀、大小和形態(tài)的分析并非總能令人信服。所以，集合了三維計算成像、信息光學和DHM非常有希望作為可靠、自動和低價的工具應用于細胞（如血液或干細胞）的快速感應、可視化和鑒定。
　　目前的DHM方法有單次曝光同軸伽柏全息顯微鏡，得益于簡單、小型和低價的系統(tǒng)，作為三維細胞鑒別具有很好的工作性能。結(jié)合微流器件和光鑷微操作等其他技術(shù)，DHM還可以可以進行更復雜的分析和細胞操作控制。

2011年06月09日