人線粒體DNA熒光定量PCR檢測方法的建立

【摘要】  建立SYBR Green I實時熒光PCR定量檢測人線粒體DNA的方法。選取人線粒體DNA高度保守基因片段，將該基因片段與pCF-T載體連接后，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，提取重組質(zhì)粒PCR及測序鑒定后，作為陽性模板建立SYBR-Green I熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。結(jié)果表明：構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(反應(yīng)體系中含101～108拷貝時,擴(kuò)增反應(yīng)CT值與拷貝數(shù)的對數(shù)成線性關(guān)系)，相關(guān)系數(shù)為0.997。批內(nèi)和批間重復(fù)性測定的變異系數(shù)分別為1.23%～3.29%以及3.10%～5.21%。我們成功建立了實時熒光定量PCR檢測人線粒體DNA的方法，該方法可作為進(jìn)一步研究線粒體DNA的方法，在相關(guān)疾病診斷和監(jiān)測中具有一定的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】  SYBR Green I；熒光定量PCR；線粒體DNA；聚合酶鏈反應(yīng)；人
    Abstract：To estiblish a SYBR-Green I fluorescent quantitative PCR method to detect human mitochondrial DNA.Human mitochondrial DNA was analyzed and special primers were designed and synthesized according to the conserved gene sequence. The specific fragment was cloned into pCF-T vector which was transformed into E.coli DH5α. The positive recombinant plasmid identified by sequencing was used as quantitative template to generate standard curve and melt curve. Results showed that the standard curve succesfully showed a linear relationship between cycle threshold(Ct)and template concentration ranging from 101 to 108 copies,and the correlation coefficient was 0.997.The coefficient of variation values for both intra-experimental and inter-experimental reproducibility ranged from 1.23% to 3.29 % and 3.10% to 5.21%, respectively.It means that the method for detecting human mitochondrial DNA with fluorescence quantitative polymerase chain reaction is developed successfully.It shows good repeatability and sensitivity in detection of human mitochondrial DNA. This method can facilitate the potential applications in the fields of laboratory diagnosis and detection.
    Key words：SYBR Green I; Fluorescent qunantitative PCR; Mitochondrial DNA；Polymerase chain reaction；Human
    1  引  言
    線粒體作為真核細(xì)胞中一種重要而獨特的細(xì)胞器，其性狀和數(shù)量的改變與人的疾病密切相關(guān)。研究線粒體與疾病的關(guān)系，既有理論意義，在醫(yī)學(xué)上也有潛在的應(yīng)用前景。稱為細(xì)胞動力工廠的線粒體，因其生命周期有限，具有高的更新率，形態(tài)、大小、數(shù)量和分布常因細(xì)胞種類不同而異。本研究旨在建立人線粒體DNA熒光定量PCR方法，為進(jìn)一步研究線粒體DNA與人的疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
    1  材料與方法
    1.1  實驗材料
    人EDTA抗凝血2 ml，菌種為本室保存的大腸桿菌E.coli DH5α。
    1.2  試劑
    pCF-T 連接試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑盒、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自TIANGEN公司；BigDye Terminator v3.1 試劑盒、SYBR PCR Mastermix  購自ABI公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自灝洋生物公司。
    1.3  儀器
    BIO-RAD公司iCycler熒光定量PCR儀，HERAEUS公司高速離心機(jī)BIOFUGEPICO，ABI公司 9700 PCR擴(kuò)增儀，大和公司恒溫金屬浴，BECKMAN公司紫外分光光度計DU-640，復(fù)星公司電泳儀，KODAK公司凝膠成像系統(tǒng)，ABI公司310測序儀。
　　 1.4  目的片段引物的設(shè)計、合成
    比較人線粒體DNA全序列，設(shè)計特異引物，引物由三博遠(yuǎn)志合成，序列如下:
    上游引物：
    5′-ATACCCATGACCAACCTCCTACTCCTCATT-3′；
    下游引物：
    5′-CTGCTCGCAGTGCGCCGATCAGGGCGTAGT-3′。
    1.5  DNA樣品的提取、擴(kuò)增及回收
    取人EDTA抗凝血2 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，分別吸取人單個核細(xì)胞（1×106/mL）5 ul，離心，棄上清。放入20 ul裂解液中(Chelex reagent), 56℃ 消化1 h，98℃ 10 min, DNA樣品-20℃保存。PCR 反應(yīng)體系：上下游引物各1 ul （10  umol/L）、dNTPS 2 ul、Taq DNA聚合酶0.5 ul、10×Taq Buffer 2.5 ul、DNA樣品2 ul、ddH2O 16 ul,輕輕混勻，短暫離心，按照下列條件進(jìn)行擴(kuò)增:94℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s,共35個循環(huán)；72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳、檢測，并用膠回收試劑盒純化回收。
    1.6  克隆載體的構(gòu)建
    回收的片段與pCFT載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌，然后利用Amp抗性進(jìn)行篩選。從平板中挑出7株轉(zhuǎn)化菌，按質(zhì)粒抽提試劑盒提供的方案配液、提取。對質(zhì)粒進(jìn)行PCR電泳鑒定，鑒定陽性的質(zhì)粒用測序證實。
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 1.7 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
  用紫外分光光度計檢測質(zhì)粒濃度人線粒體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成拷貝濃度，用水10倍梯度稀釋成108-101拷貝/u1。使用SYBR PCR Mastermix kit（ABI）,BIO-RAD iCycler PCR儀測定擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線,總反應(yīng)體系為25 μL。內(nèi)含:上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, SYBR PCR Mastermix 12.5 μL，模板1 μL，PCR級水8.5 μL。反應(yīng)條件為: 95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，每循環(huán)延伸后檢測熒光，共38個循環(huán)，72℃ 7 min。

1.8 熔解曲線的制作

95℃ 2 s后以0.3℃/3 s降溫到65℃，連續(xù)檢測熒光信號，繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線,以了解樣品擴(kuò)增的特異性,保障測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定和DNA序列分析

將構(gòu)建重組質(zhì)粒用設(shè)計的引物進(jìn)行擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)特異的目的條帶（405bp），見圖1。鑒定陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果見圖2，測序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行比對，結(jié)果序列完全相同，說明目的片段已經(jīng)成功重組。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

反應(yīng)體系中含1×101～1×108拷貝分子時，擴(kuò)增反應(yīng)CT值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=-3.320X+38.983，其中Y為CT值，X為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)，見圖3。 標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示出相關(guān)系數(shù)為0.997。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏性

將線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)品做梯度稀釋(1×101～1×108)，進(jìn)行熒光定量PCR，得到系列曲線，至每個梯度均有特征性擴(kuò)增曲線，呈明顯的“S”型，見圖4。說明用此引物通過熒光定量PCR測定人線粒體DNA敏感性好。

2.4 特異性

用抽提的線粒體DNA作為陽性模板，結(jié)果與預(yù)期完全相符,無非特異性擴(kuò)增。而非靶模板的反應(yīng)孔無熒光信號出現(xiàn)。熔解曲線只見一特異性峰, 見圖5，說明此引物特異性高，表明該方法有良好的特異性。

2.5 重復(fù)性實驗

將系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,用熒光定量PCR重復(fù)測定3次,每次每個稀釋度重復(fù)3管。結(jié)果表明,用該方法檢測的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為1.23%～3.29%以及3.10%～5.21%,說明該方法具有較好的可重復(fù)性及再現(xiàn)性。

3 討論

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，不僅維持細(xì)胞正常生理功能，在細(xì)胞凋亡和死亡中也發(fā)揮重要作用。線粒體是細(xì)胞能量生成場所，通過氧化磷酸化為有機(jī)體，提供90%的ATP能源；參與尿素循環(huán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，從而參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。線粒體參與細(xì)胞凋亡功能的發(fā)現(xiàn)加深了對細(xì)胞凋亡機(jī)制的理解。它還產(chǎn)生還原性物質(zhì)有利于細(xì)胞的解毒功能。可見，線粒體在生物的生長、發(fā)育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進(jìn)化等方面都有非常重要的意義。

近年來國內(nèi)外對mtDNA與腫瘤之間的關(guān)系有所研究，并提出了一些假說，已有的研究資料提示腫瘤的生物學(xué)特征不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且與核外的線粒體DNA也有一定的關(guān)系［1］，可能與易受損傷而不易修復(fù)有關(guān)。線粒體DNA基因組缺乏損傷修復(fù)系統(tǒng)而又直接暴露于氧化磷酸化過程所產(chǎn)生的高氧環(huán)境，是其發(fā)生損傷的重要因素。加之線粒體基因組結(jié)構(gòu)特點：(1)線粒體內(nèi)脂肪/DNA的比值很高，使具有嗜脂性的致癌物優(yōu)先在占細(xì)胞總DNA量很少的線粒體DNA聚集［2］；(2)線粒體DNA缺乏組蛋白的保護(hù)，即是裸露的。因此線粒體DNA是致癌物作用的重要靶點，其損傷程度和突變率顯著高于核DNA（大約10倍于核）［3］。由于線粒體DNA修復(fù)機(jī)制發(fā)育不良，效率低下，線粒體DNA的突變導(dǎo)致線粒體功能缺陷，線粒體DNA只有過度復(fù)制產(chǎn)生驚人的拷貝數(shù)才能補(bǔ)償此缺陷［4］。因此需要建立一個定量檢測線粒體DNA的方法。

實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。SYBR Green Ⅰ是雙鏈DNA熒光染料,通過特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)出熒光，因此，PCR 反應(yīng)中SYBR GreenⅠ的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的增加一致［5-7］ 。與傳統(tǒng)的PCR方法相比，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴(kuò)增具有高效性和高敏感性，可進(jìn)行定量分析，且通過產(chǎn)物熔解分析可確定產(chǎn)物的特異性。反應(yīng)全程為閉管操作，檢測結(jié)果由計算機(jī)完成分析，提高了工作效率，防止了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。與Taqman探針法相比，操作簡單且成本低。

本實驗中，我們通過構(gòu)建人線粒體DNA的質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，建立了線粒體DNA的定量檢測方法。結(jié)果顯示，反應(yīng)體系具有較高的檢測敏感性，能檢測到低載量（10 拷貝）的模板；模板濃度在101～108拷貝反應(yīng)時，反應(yīng)體系具有良好的重復(fù)性和特異性。與傳統(tǒng)PCR相比，擴(kuò)增效率高，并降低了產(chǎn)物可能引起的潛在污染。因此該方法的成功建立，在線粒體相關(guān)疾病的診斷、治療的監(jiān)測中有一定的應(yīng)用前景。

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