文庫篩選助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭秘T細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
文章來源：健康界發(fā)布日期：2025-03-03瀏覽次數(shù)：5 研究中，團(tuán)隊(duì)結(jié)合CRISPR篩選技術(shù)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，揭示了T細(xì)胞在靜息和激活狀態(tài)下基因表達(dá)的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過系統(tǒng)性鑒定調(diào)控IL-2Rα表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控因子，研究進(jìn)一步揭示了MED12在T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換中的核心調(diào)控作用，為免疫治療領(lǐng)域帶來了新的靶點(diǎn)和策略。T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其功能多樣性依賴于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控。T細(xì)胞的激活與靜息狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換對于維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。IL-2Rα（CD25）是T細(xì)胞激活的一個關(guān)鍵標(biāo)志，其表達(dá)水平在不同T細(xì)胞亞群中表現(xiàn)出不同的調(diào)控模式。例如，在效應(yīng)性T細(xì)胞（Teff）中，IL-2Rα在激活后會短暫高表達(dá)；而在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）中，IL-2Rα則持續(xù)高表達(dá)。然而，調(diào)控IL-2Rα表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控因子在不同細(xì)胞類型和狀態(tài)下的具體作用尚不清楚。為了全面理解IL-2Rα的調(diào)控機(jī)制，研究者們采用了CRISPR篩選技術(shù)，結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和染色質(zhì)分析，揭示了T細(xì)胞在靜息和激活狀態(tài)下基因表達(dá)的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一、CRISPR篩選流程與結(jié)果1、細(xì)胞分離與激活研究者從健康人類供體的外周血白細(xì)胞分離包（Leukopak）中分離出CD4+ T細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和效應(yīng)性T細(xì)胞（Teff）。這些細(xì)胞隨后用CD3/CD28/CD2激活劑（ImmunoCult?）刺激，以誘導(dǎo)細(xì)胞激活并表達(dá)IL-2Rα。激活后的細(xì)胞被分為三組：靜息Teff細(xì)胞、靜息Treg細(xì)胞和激活的Teff細(xì)胞。2、sgRNA文庫準(zhǔn)備與轉(zhuǎn)染研究者使用了一個包含約6000個單導(dǎo)向RNA（sgRNA）的CRISPR文庫，靶向T細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子（約1350個基因）。這些sgRNA通過病毒載體轉(zhuǎn)染到激活后的T細(xì)胞中，使每個細(xì)胞隨機(jī)獲得一個sgRNA，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。3、細(xì)胞培養(yǎng)與篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含有IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以支持細(xì)胞的存活和增殖。細(xì)胞被分為三組進(jìn)行篩選：靜息Teff細(xì)胞：培養(yǎng)10天后，篩選IL-2Rα低表達(dá)的細(xì)胞；靜息Treg細(xì)胞：培養(yǎng)10天后，篩選IL-2Rα高表達(dá)的細(xì)胞；激活Teff細(xì)胞：在培養(yǎng)9天后重新刺激細(xì)胞，72小時后篩選IL-2Rα高表達(dá)的細(xì)胞。4、細(xì)胞分選與sgRNA提取使用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）根據(jù)IL-2Rα的表達(dá)水平將細(xì)胞分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組。從分選后的細(xì)胞中提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增sgRNA序列，并進(jìn)行測序。通過MAGeCK軟件分析測序數(shù)據(jù)，識別在不同條件下影響IL-2Rα表達(dá)的基因。5、篩選結(jié)果靜息Teff細(xì)胞：篩選出多個負(fù)調(diào)控IL-2Rα的基因，例如KLF2、SOCS3、MYB等。這些基因在靜息Teff細(xì)胞中抑制IL-2Rα的表達(dá)。靜息Treg細(xì)胞：篩選出多個正調(diào)控IL-2Rα的基因，例如FOXP3、USP22、MYC等。這些基因在靜息Treg細(xì)胞中促進(jìn)IL-2Rα的表達(dá)。激活Teff細(xì)胞：篩選出多個正調(diào)控IL-2Rα的基因，例如GATA3、BATF、IRF4等。這些基因在激活的Teff細(xì)胞中促進(jìn)IL-2Rα的表達(dá)。MED12的動態(tài)調(diào)控作用：特別值得注意的是MED12，它在不同細(xì)胞類型和狀態(tài)中表現(xiàn)出動態(tài)調(diào)控作用。在靜息Teff細(xì)胞中，MED12是IL-2Rα的負(fù)調(diào)控因子；而在激活的Teff細(xì)胞和Treg細(xì)胞中，MED12則是正調(diào)控因子。MED12的缺失導(dǎo)致T細(xì)胞無法完全進(jìn)入靜息狀態(tài)或達(dá)到激活狀態(tài)，而是處于一個中間狀態(tài)。二、 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證CRISPR篩選結(jié)果并揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究者們在靜息和激活狀態(tài)下的Treg和Teff細(xì)胞中進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（Perturb-seq）。通過分析每個基因敲除對細(xì)胞整體轉(zhuǎn)錄組的影響，研究者們構(gòu)建了T細(xì)胞在不同狀態(tài)下的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。靜息Teff細(xì)胞：KLF2、SOCS3和MYB等基因被確認(rèn)為靜息Teff細(xì)胞中IL-2Rα的負(fù)調(diào)控因子。敲除這些基因后，IL-2Rα表達(dá)增加。激活Teff細(xì)胞：GATA3、BATF和IRF4等基因被確認(rèn)為激活Teff細(xì)胞中IL-2Rα的正調(diào)控因子。敲除這些基因后，IL-2Rα表達(dá)降低。MED12的全局調(diào)控作用：MED12的敲除導(dǎo)致靜息Teff細(xì)胞中IL-2Rα表達(dá)增加，而在激活的Teff細(xì)胞和Treg細(xì)胞中，IL-2Rα表達(dá)降低。這表明MED12在T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用。三、 MED12的調(diào)控機(jī)制研究1、染色質(zhì)分析MED12與COMPASS復(fù)合體（組蛋白甲基化復(fù)合體）相互作用，調(diào)控組蛋白H3K4的甲基化。在靜息Teff細(xì)胞中，MED12的缺失導(dǎo)致H3K4me3水平降低，而在激活的Teff細(xì)胞中，MED12的缺失導(dǎo)致H3K4me3水平增加。2、基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)MED12通過調(diào)控多個關(guān)鍵因子（如KLF2、MYC、ETS1等）來維持T細(xì)胞的靜息狀態(tài)或促進(jìn)激活。在靜息Teff細(xì)胞中，MED12促進(jìn)KLF2的表達(dá)，從而抑制IL-2Rα；在激活的Teff細(xì)胞中，MED12促進(jìn)MYC和GATA3的表達(dá)，從而促進(jìn)IL-2Rα的表達(dá)。四、MED12對細(xì)胞狀態(tài)的影響1、細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換MED12的缺失導(dǎo)致T細(xì)胞無法完全進(jìn)入靜息狀態(tài)或達(dá)到激活狀態(tài)，而是處于一個中間狀態(tài)。這表明MED12在T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用。2、細(xì)胞存活和增殖MED12的缺失限制了激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD），從而提高了T細(xì)胞的存活率和增殖能力。這可能對T細(xì)胞的持久性有積極影響。五、 研究意義通過CRISPR篩選和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，研究者們揭示了T細(xì)胞在靜息和激活狀態(tài)下基因表達(dá)的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。MED12的調(diào)控作用為開發(fā)新的免疫治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。例如，通過調(diào)節(jié)MED12的活性，可以增強(qiáng)T細(xì)胞的持久性和功能，從而提高免疫治療的效果。 
