紫杉醇對涎腺腺樣囊性癌實驗性肺轉移的抑制作用

【摘要】  目的觀察紫杉醇對人高轉移性涎腺腺樣囊性癌細胞(ACCM)在裸鼠體內肺轉移的抑制作用。方法22只裸鼠,尾靜脈注射接種ACCM細胞建立實驗性肺轉移模型,隨機分為紫杉醇組和對照組。紫杉醇組于接種腫瘤細胞后第2 天起腹腔注射紫杉醇10 mg/kg,3 d注射1次,共10次;對照組同期腹腔注射等量溶劑。接種6周后處死實驗動物。觀察發(fā)生腫瘤肺轉移的裸鼠數目,稱體質量;解剖裸鼠肺臟,稱質量;記錄肺轉移灶數目。結果對照組和紫杉醇組相比,肺轉移率 vs 54.54%,肺轉移結節(jié)數(28.64±10.69) vs (15.17±4.83),轉移肺濕質量(0.702±0.044)g vs (0.524±0.046)ｇ,2組比較差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論紫杉醇對ACCM細胞肺轉移具有明顯抑制作用。

【關鍵詞】  癌 腺樣囊性 紫杉醇 肺腫瘤 腫瘤轉移

    腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是口腔頜面部常見的唾液腺惡性腫瘤。國內統(tǒng)計腺樣囊性癌占唾液腺腫瘤的9.95%,占唾液腺惡性腫瘤的24%,居第2位[1]。其主要表現(xiàn)為侵襲性強,易發(fā)生遠處轉移,以肺轉移多見。目前多采用手術擴大切除輔以放、化療的綜合治療,但術后局部復發(fā)率高達42%,遠處轉移率可達32%[13]。目前,不少學者認為常用的化療藥物[如順鉑(DDP),5氟尿嘧啶(5FU),阿霉素等]控制ACC轉移的療效不佳,因此選擇特異性化療藥物始終是ACC治療和抗轉移的目標之一[1]。紫杉醇(palitaxel)是一種由紅豆杉屬植物的樹皮提取的化合物,是近年來研究開發(fā)的一類化學結構新穎、作用機制獨特的新型抗腫瘤藥,具有抗腫瘤侵襲和轉移的作用。已證實對晚期卵巢腫瘤、轉移性乳腺腫瘤有明顯療效。筆者通過建立無胸腺裸小鼠實驗性ACC肺轉移動物模型,觀察紫杉醇對ACC肺轉移的抑制作用,了解紫杉醇動物體內抗ACCM細胞肺轉移能力。

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1藥品紫杉醇(泰素,美國百時美施貴寶公司),原包裝注射液30 mg/mL,保存在-20 ℃冰箱,使用時取1 mL用生理鹽水配制成相應濃度為0.2 mg/mL的工作液,4 ℃冰箱保存;小牛血清(美國Hyclone公司);RPMI 1640培養(yǎng)基干粉(美國Gibco公司)。

    1.1.2動物雄性,BALB/C,nu/nu,無胸腺裸小鼠,SPF級,6~8周齡,體質量18~20 g,由中國科學院上海實驗動物中心提供[動物合格證號:SCXK(滬)20020012],福建醫(yī)科大學動物中心飼養(yǎng),飼料、水、飼養(yǎng)籠、墊料均經高壓無菌消毒,SPF條件下飼養(yǎng),所有操作均在超凈臺上處理。22只裸鼠等質量隨機分為紫杉醇組和生理鹽水組(對照組)，體質量差別無統(tǒng)計學意義[(20.3±1.64)g vs (20.6±1.38)g]。

    1.2方法

    1.2.1細胞培養(yǎng)肺高轉移人涎腺腺ACC細胞株(ACCM)由上?？谇会t(yī)學研究所建株[4],由上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科實驗室提供。細胞培養(yǎng)在福建醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中心實驗室進行。ACCM細胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,37 ℃、體積分數為0.05的CO2條件下培養(yǎng),每3~4天按1∶4~1∶5傳代。

    1.2.2ACCM細胞裸小鼠肺轉移動物模型及藥物用法(1)處于指數生長期的細胞經0.125%胰酶消化,吹打成單細胞懸液,細胞經1 000 r/min離心5 min,棄去上清,加入Hank's液吹打后再離心,重復3次,用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋,調整細胞濃度為5×106 mL1備用;(2)裸鼠放入固定器中,在嚴格無菌條件下經尾靜脈注入細胞懸液，每只0.2 mL(1×106個細胞);(3)細胞接種后第2天起,紫杉醇組每只按10 mg/kg紫杉醇腹腔給藥,藥物劑量參照文獻[6]換算,3 d注射1次;對照組予同樣體積的生理鹽水,3 d注射1次,共10次,于接種后6周末斷頸處死動物。

    1.3觀察指標給藥期間觀察裸鼠的一般情況,接種ACCM細胞6周后斷頸處死,稱量裸鼠體質量;解剖肺臟,清洗后電子天平稱肺質量;壓片計數法記錄肺轉移灶數目;中性福爾馬林固定肺組織,常規(guī)石蠟切片,HE染色,進行組織病理學檢查。

    1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析,結果設α=0.05。裸鼠體質量、肺質量、轉移灶數目用方差不齊的t'檢驗,轉移率用χ2檢驗。

    2結果

    2.1肺轉移動物數、肺轉移率、肺表面轉移結節(jié)數及裸鼠肺質量兩組比較,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表1)。

    2.2一般情況實驗前對照組體質量與紫杉醇組差別無統(tǒng)計學意義。用藥期間,紫杉醇組活動良好,飲食正常,未見感染及其他不良反應;對照組自第5周左右開始消瘦,體質量略有下降,2組比較差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表1);動物心、肝、脾、腎組織無特殊病理改變,提示紫杉醇對裸鼠ACCM肺轉移灶生長抑制作用較好,也較低。

    2.3腫瘤標本ACCM肺轉移的裸鼠后期外形消瘦,體質量較未出現(xiàn)腫瘤肺轉移者有一定程度的表1紫杉醇對ACCM裸鼠肺轉移的抑制作用下降。肺表面及實質內均可見圓形或橢圓形轉移灶,呈散在性結節(jié)狀突起。肺轉移嚴重者瘤結節(jié)大而多,突出于肺表面,多個瘤結節(jié)融合成團。對照組ACCM肺轉移灶明顯大于紫杉醇組,鏡下見瘤細胞排列成實性團塊,瘤細胞為圓形或多邊形,排列緊密,細胞質少,細胞核較小呈圓形,核分裂較多見;瘤塊中央見壞死灶,部分小血管內可見瘤栓(圖1A)。紫杉醇組肺轉移灶數量較少,瘤體較小,多分布于肺表面,鏡下病灶小,瘤細胞體積小,細胞之間有裂隙,核分裂少,甚至僅可見腫瘤細胞團(圖1B)。

    3討論

    ACC是常見的唾液腺惡性腫瘤,生長緩慢但侵襲性強,易發(fā)生遠處轉移,以肺為多見,預后較差。多年來多種化療藥物被試用于臨床,目前臨床常用的化療方案是1986年我國涎腺協(xié)作組制定的PVF(CDDP+VCR+5FU)3周用藥方案,但在控制ACC的肺轉移未取得明顯療效[7]。

    侵襲和轉移是惡性腫瘤的特征。侵襲和轉移并非完全呈連續(xù)性,有的侵襲并不一定終表達轉移,但轉移是由多步驟侵襲發(fā)展而成的。腫瘤轉移既與腫瘤本身的特性有關,又受宿主內在各種因素

    制約,就腫瘤本身而言難以在體外進行研究[8]。ACC具有較高的肺轉移傾向,ACCM細胞株的篩選及動物模型的建立,為其轉移機制和抗轉移的研究提供了有力的手段?？罐D移的動物實驗模型應該大程度反映轉移過程的各種復雜關系。為更好地模擬轉移全過程,目前常用的移植性腫瘤實驗模型有自發(fā)性轉移模型和實驗性轉移模型。實驗性轉移模型主要反映瘤細胞進入血循環(huán)后癌的幾個轉移步驟,與臨床手術切除腫瘤后可能的血行轉移相似。在新抗癌藥物篩選中,常用移植性腫瘤實驗模型。關曉峰等成功分離培養(yǎng)了ACCM細胞株,并建立了肺轉移裸鼠模型[45]。本研究中,使用實驗性肺轉移模型,模擬自發(fā)性肺轉移模型作為抗腫瘤治療的研究對象,基本滿足了研究需要,也為進一步系列研究ACC構建一個切實可行的研究平臺。但在實驗中尾靜脈注射技術操作要求高,不易掌握;實驗動物裸小鼠缺乏免疫反應,抗感染能力差,飼養(yǎng)條件要求較高。

    紫杉醇是一種新的高效抗癌藥物。一般認為紫杉醇的主要作用靶區(qū)是微管蛋白/微管系統(tǒng)。紫杉醇可使微管蛋白和組成微管的微管蛋白二聚體失去動態(tài)平衡,誘導與促進微管蛋白聚合、裝配,防止解聚,使微管穩(wěn)定,從而阻止腫瘤細胞的生長[9]。近年來紫杉醇的抗侵襲轉移能力及抗血管生成的作用漸漸為人們所認識[10]。在國內外的腫瘤研究中,實驗研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇具有抑制多種腫瘤細胞侵襲轉移的能力[1113],臨床研究也表明紫杉醇對晚期卵巢腫瘤、轉移性乳腺腫瘤治愈率為10％以上[14]。紫杉醇的體內抗腫瘤侵襲轉移能力及其機制的研究還為數不多。

    筆者在前期研究表明,紫杉醇對ACC細胞有較好的抗癌作用,在此基礎上還進行了紫杉醇對ACCM細胞侵襲能力的影響的體外實驗,發(fā)現(xiàn)紫杉醇在體外能明顯抑制ACC高轉移細胞株ACCM的侵襲能力,具有轉移抑制潛能[1517]。本研究則著重觀察紫杉醇在裸鼠體內抑制ACCM細胞株肺轉移的能力,發(fā)現(xiàn)單獨應用紫杉醇對移植在裸鼠體內ACCM的肺轉移具有顯著抑制作用,其轉移率降低,而且肺轉移灶數目減少,含轉移灶肺濕質量較對照組降低,轉移灶計數多者其含轉移灶的肺質量也增加,與對照組比較差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。紫杉醇組活動良好,飲食正常,未見感染及其他不良反應,體質量變化不明顯;對照組由于ACC肺轉移在晚期出現(xiàn)消瘦,體質量略有下降。

    本實驗表明紫杉醇在裸鼠體內具有很強的抑制ACCM細胞株肺轉移的能力?？赏麨榕R床有效治療ACC提供新方法,其抗轉移機制將進一步探討。

【參考文獻】
  \[2\]林國礎. 涎腺癌的遠處轉移\[J\]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學, 1990,4(2):65.

\[3\]Spiro R H. Distant me[x]tastasis in adenoid cystic carcinoma of salivary origin\[J\]. Am J Surg, 1997,174(5):495498.

\[4\]關曉峰,邱蔚六,何榮根,等. 肺高轉移性涎腺腺樣囊性癌細胞株的篩選\[J\]. 中華口腔醫(yī)學雜志, 1996,31(2):7477.

\[5\]關曉峰,邱蔚六,何榮根. 人涎腺腺樣囊性癌肺轉移裸鼠模型的建立\[J\]. 華西口腔醫(yī)學雜志, 1995,13(3):147150.

\[6\]施新猷. 現(xiàn)代醫(yī)學實驗動物學\[M\]. 北京:人民軍醫(yī)出版社, 2000:565572.

\[7\]俞光巖. 涎腺疾病\[M\]. 北京:北京醫(yī)科大學、中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1994: 124125.

\[8\]高進,章靜波. 癌的侵襲與轉移基礎與臨床\[M\]. 北京:北京醫(yī)科大學、中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社, 2003:277312.

\[9\]張英鋒,范林. 抗癌藥物紫杉醇的制備、抗癌機理和應用前景\[J\]. 化學教育, 2007,28(1):710.

\[10\]Chun E,Lee K Y.Bcl2 and BclxL are important for the induction of paclitaxel resistance in human hepatocellular carcinoma cells\[J\]. Biochem Biophys Res Comm, 2004,315(3):771779.

\[11\]周龍恩,劉紅巖,徐少鋒,等. 紫杉醇對MDAMB435人乳腺癌高轉移細胞粘附、侵襲及遷移能力的影響\[J\]. 中國藥理學和毒理學雜志, 2001,15(1):5155.

\[12\]WesterlundA,Hujanen E,Hoyhtya M,et al. Ovarian cancer cell invasion is inhibited by paclitaxel\[J\]. Clin Exp me[x]tastasis, 1997,15(3):318328.

\[13\]Yin D S,Ge Z Q,Yang W Y,et al. Inhibition of tumor me[x]tastasis in vivo by combination of paclitaxel and hyaluronic acid\[J\]. Cancer Lett, 2006,243(1):7179.

\[14\]Tortoriello A,Facchini G,Caponigro F,et al. Phase Ⅰ/Ⅱ study of paclitaxol and vinorelbinein me[x]tastatic breast cancer\[J\]. Breast Cancer Res Treat, 1998,47(1):9197.

\[15\]林李嵩,林國礎,陳萬濤,等. 紫杉醇對腺樣囊性癌抗瘤作用及對細胞周期的影響\[J\]. 中華口腔醫(yī)學雜志, 2001,36(6):416.

\[16\]林李嵩,林國礎,陳萬濤,等. 紫杉醇誘導ACC細胞凋亡及與G2/M期阻滯關系研究\[J\]. 中華口腔醫(yī)學雜志, 2002,36(2):9496.

\[17\]林耿冰,林李嵩,陳乃俊,等. 紫杉醇對腺樣囊性癌細胞侵襲力及明膠酶的影響\[J\]. 中國口腔頜面外科雜志, 2006,4(2):127131.

作者：朱小峰

作者單位：福建醫(yī)科大學 附屬醫(yī)院口腔頜面外科