癌癥治療新突破：短IL-18對(duì)腫瘤的治療意義

該研究發(fā)現(xiàn)，由caspase-3切割產(chǎn)生的短IL-18能夠動(dòng)員自然殺傷（Nature Killer，NK）細(xì)胞，從而抑制腫瘤生長，這一發(fā)現(xiàn)為癌癥免疫治療提供了新的思路。

IL-18，一種在免疫應(yīng)答中扮演重要角色的細(xì)胞因子，通常以18-kDa的成熟形式發(fā)揮作用，由caspase-1切割產(chǎn)生。然而，除了這種成熟形式，IL-18還可以被其他蛋白酶處理，生成不同功能的片段。本研究發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中，caspase-3能夠切割I(lǐng)L-18，產(chǎn)生一個(gè)15-kDa的短IL-18。與成熟IL-18不同，短IL-18不分泌，不與IL-18Rα結(jié)合，而是轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，通過CDK8促進(jìn)STAT1在Ser727位點(diǎn)的磷酸化，并增強(qiáng)ISG15的表達(dá)和分泌。這一發(fā)現(xiàn)揭示了短IL-18在腫瘤免疫中的潛在作用，為癌癥治療提供了新的視角。

成熟IL-18和短IL-18抗腫瘤功能機(jī)制的示意性模型

研究結(jié)果

1、Caspase-3切割產(chǎn)生的短IL-18不會(huì)分泌，而是定位在細(xì)胞核中

研究發(fā)現(xiàn)，僅caspase-3能將重組IL-18切割成15kDa的短IL-18，而其他凋亡相關(guān)caspase（例如caspase-7、-8、-9）則無此功能（圖1a-b）。MEROPS 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)小鼠IL-18中caspase-3的切割位點(diǎn)為D69，人IL-18中為D71/D76，且caspase-1和caspase-3的切割位點(diǎn)在不同物種中高度保守。當(dāng)這些天冬氨酸位點(diǎn)被丙氨酸取代時(shí)，突變體在HEK293T細(xì)胞中經(jīng)raptinal刺激后抵抗caspase-3切割或在與活性rhCASP3孵育時(shí)抵抗切割，但仍對(duì)caspase-1切割敏感。因此，caspase-3在D69（小鼠）和 D71/D76（人）位點(diǎn)切割I(lǐng)L-18產(chǎn)生短IL-18。有趣的是，只有成熟 IL-18，而不是短IL-18片段，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ，表明短IL-18的功能與成熟IL-18不同。并且短IL-18僅在細(xì)胞裂解物中存在，上清液中未發(fā)現(xiàn)其被分泌。此外，作者進(jìn)一步研究了短IL-18的細(xì)胞定位，與定位于細(xì)胞質(zhì)的pro-IL-18或N-IL-18不同，短IL-18僅定位于細(xì)胞核，Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)其不會(huì)與IL-18Rα互作。

2、短IL-18不依賴IL-18R抑制腫瘤生長

首先，作者檢測(cè)了不同癌細(xì)胞系中IL-18的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺癌(E0771)和結(jié)腸腺癌(MC38)細(xì)胞中可檢測(cè)到IL-18，但B16-F10黑色素瘤、LLC肺癌、4T1乳腺癌或EG7 T淋巴瘤細(xì)胞中未檢測(cè)到。敲除或敲低IL18會(huì)加速免疫正常小鼠的腫瘤生長，而野生型(WT)IL-18在sgIL18-MC38細(xì)胞中重新表達(dá)則抑制了腫瘤生長。同樣，IL-18 WT在B16-F10細(xì)胞中的異位表達(dá)抑制了腫瘤生長，而IL-18 D69A則沒有。免疫印跡確認(rèn)在IL-18表達(dá)完整的腫瘤樣本中存在短IL-18，但不存在成熟IL-18。過表達(dá)caspase-1抗性IL-18 D35A的腫瘤仍保留腫瘤抑制活性，表明癌細(xì)胞內(nèi)源性IL-18的抗腫瘤功能是由短IL-18而非成熟IL-18介導(dǎo)的。接下來，作者在B16-F10細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)短IL-18和N-IL-18，并評(píng)估了免疫正常小鼠的腫瘤生長情況。結(jié)果表明，過表達(dá)短IL-18的B16-F10腫瘤比過表達(dá)N-IL-18的腫瘤表現(xiàn)出更強(qiáng)的監(jiān)視和抑制腫瘤進(jìn)展的能力。此外，作者設(shè)計(jì)了腺病毒載體以直接將短IL-18遞送至腫瘤中，與adv-CV相比，瘤內(nèi)注射adv-短IL-1抑制了腫瘤生長并提高了小鼠的存活率。因此，癌細(xì)胞內(nèi)源性短IL-18在免疫正常小鼠中抑制了腫瘤生長。在IL18受體缺陷的IL18r1?/?小鼠中，過表達(dá)IL-18 WT的B16-F10細(xì)胞仍能抑制腫瘤生長，而IL-18 D69A突變體則不能。另外，瘤內(nèi)注射adv-短IL-18在IL18r1?/?小鼠中仍能少腫瘤生長，效果與WT小鼠相當(dāng)。這些結(jié)果表明，癌細(xì)胞內(nèi)源性短IL-18獨(dú)立于成熟IL-18/IL-18R軸抑制腫瘤生長。

3、短IL-18通過動(dòng)員NK細(xì)胞抑制腫瘤生長

隨后作者深入研究了短IL-18的抗腫瘤機(jī)制。首先作者評(píng)估了短IL-18過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，包括其對(duì)增殖和凋亡反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，短IL-18的腫瘤抑制作用是通過完整的宿主免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。然后作者還分析了腫瘤微環(huán)境(TME)中的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-18缺陷的MC38和E0771腫瘤中腫瘤浸潤的NK 細(xì)胞減少（，而表達(dá)IL-18 WT的B16-F10腫瘤表現(xiàn)出更多的腫瘤浸潤NK細(xì)胞。過表達(dá)IL-18 WT或IL-18 D35A的B16-F10腫瘤中NK細(xì)胞群增加，IFNγ+ NK細(xì)胞比例高于IL-18 D69A。瘤內(nèi)注射adv-短IL-18在WT和IL18r1?/?小鼠中均支持NK細(xì)胞群。事實(shí)上，當(dāng)我們?cè)谛∈笾兄踩隝L-18 WT和IL-18 D69A過表達(dá)的B16-F10腫瘤并進(jìn)行NK細(xì)胞耗竭時(shí)，短IL-18 的抗腫瘤效應(yīng)基本被消除。此外，作者用紫外線(UV)照射IL-18 WT和IL-18 D69A過表達(dá)的B16-F10細(xì)胞，并收集這種條件培養(yǎng)基刺激WT或IL18r1?/?NK細(xì)胞。結(jié)果表明，與IL-18 D69A突變體培養(yǎng)基相比，含有IL-18 WT過表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)基增強(qiáng)了NK細(xì)胞（WT或IL18r1?/?）的活化，表現(xiàn)為Cd69、Ifng、Gzmb和Cd107的上調(diào)。因此，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)NK細(xì)胞在介導(dǎo)短 IL-18的抗腫瘤功能中起核心作用，獨(dú)立于IL-18R介導(dǎo)的信號(hào)。

4、短IL-18延緩AOM/SS CRC模型中的腫瘤發(fā)生

為研究短IL-18在體內(nèi)的內(nèi)源性功能，作者構(gòu)建了IL18D69A小鼠系。與體外數(shù)據(jù)一致，IL18D69A突變僅影響短IL-18的生成，而不影響成熟IL-18的生成和功能接著作者使用慢性AOM+DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(CRC)小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，IL18D69A小鼠在第一個(gè)周期中的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度更高，表現(xiàn)為體重減輕。此外，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，IL18D69A小鼠表現(xiàn)出更多和更大的腫瘤以及結(jié)腸縮短。因此，Il18D69A小鼠由于缺乏短IL-18而更易患CRC。一致地，在該模型中，從Il18D69A小鼠結(jié)腸的固有層淋巴細(xì)胞(LPLs)中分選的NK細(xì)胞、GzmB+NK細(xì)胞和IFNγ+NK細(xì)胞的百分比低于WT小鼠；而CD8+T細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了短IL-18在抑制腫瘤發(fā)展和增強(qiáng)CRC中NK細(xì)胞的抗腫瘤功能中的關(guān)鍵作用。

5、短IL-18通過促進(jìn)STAT1磷酸化動(dòng)員NK細(xì)胞

為深入了解短IL-18動(dòng)員NK細(xì)胞的分子作用機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA-seq分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-18 WT樣本中上調(diào)的基因與NK細(xì)胞功能密切相關(guān)。值得注意的是，與IFN和JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在表達(dá)IL-18 WT的樣本中明顯富集。隨后，作者評(píng)估了IL-18 WT和IL-18 D69A過表達(dá)的 B16-F10腫瘤中STAT1在Ser727和Tyr701位點(diǎn)的磷酸化情況。值得注意的是，與IL-18 D69A突變體相比，IL-18 WT過表達(dá)腫瘤中STAT1在Ser727位點(diǎn)的磷酸增加，而Tyr701位點(diǎn)的磷酸化沒有增加。此外，典型STAT1目標(biāo)基因ISG15 在IL-18 WT過表達(dá)樣本中的表達(dá)也明顯上調(diào)。因此，STAT1信號(hào)在體內(nèi)被激活，并在IL-18 WT過表達(dá)的腫瘤中增強(qiáng)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)IFNγ加TNF聯(lián)合處理后，癌細(xì)胞中的pro-IL-18被切割成短IL-18，促進(jìn)了STAT1在Ser727位點(diǎn)的磷酸化，而在Tyr701位點(diǎn)的磷酸化則無變化；這一效應(yīng)完全被caspase-3抑制劑z-DEVD阻斷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)短IL-18還促進(jìn)了STAT1的激活和下游ISG的表達(dá)。用來自IL-18 WT過表達(dá)的B16-F10細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的激活，而STAT1沉默則消除了這一效應(yīng)。與這些體外實(shí)驗(yàn)一致，當(dāng)在同種腫瘤小鼠模型中敲低STAT1表達(dá)時(shí)，短IL-18的抗腫瘤功能受損。在IL-18 WT過表達(dá)的B16-F10腫瘤中，當(dāng)Stat1被敲低時(shí)，TME中的NK細(xì)胞百分比以及IFNγ分泌的NK細(xì)胞減少。上述這些結(jié)果共同表明，癌細(xì)胞內(nèi)源性短IL-18與STAT1協(xié)同作用，動(dòng)員NK細(xì)胞。

6、短IL-18與CDK8互作激活STAT1

作者對(duì)腫瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行了質(zhì)譜分析以確定癌細(xì)胞上清中受短IL-18-STAT1軸調(diào)控的分子。結(jié)果顯示，短IL-18增強(qiáng)了ISG15蛋白的分泌。此外，由于短IL-18增強(qiáng)了STAT1與ISG15啟動(dòng)子的結(jié)合，它促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞中 ISG15的表達(dá)和分泌。用重組ISG15補(bǔ)充腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的ISG15可以恢復(fù)NK細(xì)胞的活化。同樣，用來自IL-18 WT過表達(dá)的B16-F10細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞增強(qiáng)了NK細(xì)胞的激活，但在這些細(xì)胞中敲除ISG15減少了這一效果。這些發(fā)現(xiàn)表明，短IL-18通過促進(jìn)STAT1活化和ISG15分泌來支持TME中NK細(xì)胞的功能。此外，短IL-18對(duì)ISG15的促進(jìn)作用減少了NK細(xì)胞和IFNγ產(chǎn)生NK細(xì)胞在TME中的數(shù)量。另外作者還發(fā)現(xiàn)用CDK8抑制劑而非CDK4或CDK7抑制劑能有效減少短IL-18誘導(dǎo)的STAT1在Ser727位點(diǎn)的磷酸。接下來的研究發(fā)現(xiàn)短IL-18 和CDK8在核內(nèi)有明顯的共定位。短IL-18 可能主要與CDK8的激酶域中的三個(gè)區(qū)域互作：29-34、194-198和236-246位點(diǎn)，并且值得注意的是，刪除兩個(gè)基序幾乎消除了CDK8與短IL-18的相互作用。進(jìn)一步的研究表明，短IL-18增強(qiáng)了CDK8的激酶活性，導(dǎo)致STAT1在Ser727位點(diǎn)的磷酸化增加。

7、短IL-18/pSTAT1（Ser727）/CD56軸的臨床意義

人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas）數(shù)據(jù)庫顯示與健康人群相比，CRC患者的IL-18核內(nèi)定位較少。為進(jìn)一步研究，作者首先確認(rèn)了四種人類CRC細(xì)胞系中不同IL-18形式的細(xì)胞定位。與小鼠細(xì)胞系的發(fā)現(xiàn)一致，人類pro-IL-18也定位于細(xì)胞質(zhì)中，而只有由caspase-3切割產(chǎn)生的短IL-18轉(zhuǎn)位到核內(nèi)。因此，核內(nèi)IL-18僅是短IL-18。為評(píng)估短IL-18在CRC中的臨床相關(guān)性，作者對(duì)包含117對(duì)CRC和正常組織的組織陣列進(jìn)行了IL-18的免疫組化（IHC）染色。結(jié)果表明，CRC組織中核內(nèi)IL-18（短IL-18）的蛋白水平較低。此外，核內(nèi)定位的IL-18蛋白水平較低與CRC患者較短的總生存期相關(guān)，表明短IL-18的增加與CRC患者較好的預(yù)后相關(guān)。作者還發(fā)現(xiàn)STAT1在Ser727位點(diǎn)的磷酸化水平與短IL-18的趨勢(shì)一致。短IL-18的蛋白量與CRC組織中pSTAT1（Ser727）的蛋白量相關(guān)。此外，約30%的CRC組織表現(xiàn)出短IL-18和pSTAT1(Ser727))的高表達(dá)。并且短IL-18蛋白水平也與CRC組織中的NK細(xì)胞標(biāo)志物CD56水平相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，短IL-18/pSTAT1（Ser727）/CD56軸可能在抑制人CRC腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

研究小結(jié)

1、短IL-18的產(chǎn)生與特性：研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3在D69位點(diǎn)切割I(lǐng)L-18，生成短IL-18。與成熟IL-18不同，短IL-18不分泌到細(xì)胞外，而是定位于細(xì)胞核內(nèi)。這一特性使得短IL-18能夠通過與CDK8相互作用，促進(jìn)STAT1在Ser727位點(diǎn)的磷酸化，從而增強(qiáng)ISG15的表達(dá)和分泌。

2、短IL-18對(duì)NK細(xì)胞的激活：短IL-18通過上調(diào)ISG15的表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性和細(xì)胞毒性。ISG15能夠與NK細(xì)胞表面的LFA-1α結(jié)合，促進(jìn)NK細(xì)胞的活化和IFNγ的產(chǎn)生。這一機(jī)制在多種腫瘤模型中得到了驗(yàn)證，顯示出短IL-18在抑制腫瘤生長中的重要作用。

3、臨床意義：在結(jié)直腸癌患者中，短IL-18在細(xì)胞核中的高表達(dá)與更好的預(yù)后相關(guān)。這表明短IL-18可能作為一種潛在的生物標(biāo)志物，用于評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后和治療效果。