群體表觀遺傳學(xué)：植物組學(xué)時代的DNA甲基化研究
文章來源：健康界發(fā)布日期：2024-08-21瀏覽次數(shù)：12 DNA甲基化在許多生物過程中發(fā)揮著重要作用。得益于數(shù)十年來對DNA甲基化突變體的研究，如今對DNA甲基化的建立和維持機制有了很好的理解，尤其在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的Col-0品系中的研究。研究利用自然品系甲基化組進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWASs）從群體水平上揭示了DNA甲基化變化的復(fù)雜而獨特的遺傳基礎(chǔ)。亞硫酸鹽處理后的測序是量化DNA甲基化的杰出方法，此外開發(fā)的無亞硫酸鹽檢測甲基化方法，以及同時檢測遺傳和表觀遺傳信息的具有成本效益的方法。本文還討論了特定擬南芥品系中DNA甲基化的可塑性，DNA甲基化在植物適應(yīng)環(huán)境中的作用，以及自然群體中DNA甲基化變化的遺傳決定因素。開發(fā)的技術(shù)和知識將極大地促進(jìn)未來在群體表觀基因組學(xué)領(lǐng)域的研究。 DNA甲基化全基因組檢測技術(shù) 基于亞硫酸鹽的二代測序 DNA甲基化研究的第一步是在特定位點或全基因組范圍內(nèi)檢測和定量甲基化水平。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)十種方法，在這些方法中，基于亞硫酸鹽的方法使用為廣泛。全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）已成為在單堿基分辨率下定量檢測DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。亞硫酸鹽處理DNA時，會將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變。經(jīng)過PCR擴增后，未甲基化的胞嘧啶在測序時會呈現(xiàn)為胸腺嘧啶。將WGBS數(shù)據(jù)與參考序列比對后，根據(jù)特定位點上胸腺嘧啶比例鑒定每個胞嘧啶的甲基化水平。為準(zhǔn)確定量甲基化水平，WGBS覆蓋度要求通常比基于單核苷酸多態(tài)性鑒定的全基因組測序（WGS）更高?？赡軙拗芖GBS在群體水平上對大基因組物種的應(yīng)用，如玉米（Zea mays）（2.1 Gb）和小麥（Triticum aestivum，14.5Gb）。為克服這一限制開發(fā)出多種替代策略來捕獲目標(biāo)基因組區(qū)域的DNA甲基化，如簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）、甲基化DNA免疫沉淀測序（MeDIP-seq）、全基因組DNA甲基化芯片以及修飾胞嘧啶轉(zhuǎn)化捕獲方法。 不基于亞硫酸鹽的甲基化測序 基于亞硫酸鹽測序方法的局限在于文庫制備和甲基化比對中的固有偏差，這主要是由于在胞嘧啶轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中亞硫酸鹽處理條件嚴(yán)格，難以將短讀長比對到包含重復(fù)DNA序列的基因組區(qū)域。偏差可能是未甲基化胞嘧啶富集的基因組區(qū)域更快降解、胞嘧啶轉(zhuǎn)化不完全以及由堿基含量偏倚引起的PCR偏差。近年來為減少這種偏差，開發(fā)許多無亞硫酸鹽策略，如通過第三代測序或基于酶促反應(yīng)的測序技術(shù)。 表1：全基因組DNA甲基化定量方法比較 圖1：用于定量檢測DNA甲基化的無亞硫酸鹽方法。 A) Nanopore長讀長測序。 B) SMRT長讀長測序。 C-E) 兩種基于酶促的測序方法。 同時檢測遺傳和表觀遺傳信息 MethylSaferSeqS和5-letter-seq能夠同時檢測遺傳信息和甲基化狀態(tài)。與亞硫酸鹽文庫制備相比，MethylSaferSeqS在PCR后將分離原始DNA模板和擴增產(chǎn)物，分別用作后續(xù)WGBS和WGS的input文庫。而5-letter-seq在單個文庫中保留了遺傳和表觀遺傳信息，將片段化DNA的兩端連接到含有尿嘧啶殘基的發(fā)夾接頭上，隨后使用尿嘧啶特異性切除試劑處理，將兩條DNA鏈分開；合成cDNA鏈后，得到的擴增子形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，一條鏈包含原始的表觀遺傳信息，互補鏈保留遺傳信息。在與測序接頭連接后，甲基化胞嘧啶通過TET和BGT被APOBEC3A保護(hù)免受氧化，而未甲基化胞嘧啶則通過APOBEC3A和UvrD解旋酶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。甲基化胞嘧啶保持不變，未甲基化胞嘧啶在測序reads片段被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。根據(jù)解碼規(guī)則，可以從每個發(fā)夾的測序reads片段中區(qū)分甲基化和未甲基化胞嘧啶。5-letter-seq可以在單個文庫中確定遺傳序列和DNA甲基化水平，大幅降低群體中甲基化研究成本。這些方法在群體表觀基因組學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，該領(lǐng)域需要關(guān)于基因突變和甲基化模式信息，特別對于大基因組物種。 單細(xì)胞DNA甲基化分析 在活細(xì)胞中，DNA胞嘧啶應(yīng)該處于兩種狀態(tài)之一（即甲基化或未甲基化）。然而，由于細(xì)胞異質(zhì)性和組織及個體樣本混合，甲基化水平經(jīng)常在未甲基化到完全甲基化之間定量變化。在過去十年中，已經(jīng)開發(fā)了十多種方法，用于從單一細(xì)胞中分析哺乳動物的DNA甲基化，包括單細(xì)胞簡化亞硫酸鹽測序（scRRBS）、單細(xì)胞亞硫酸鹽測序（scBS-seq）、單細(xì)胞CpG島甲基化測序（scCGI-seq）；Smart-RRBS用于單個細(xì)胞中的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析；單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)（scNOMeRe-seq）用于從同一個單細(xì)胞中同時進(jìn)行染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和RNA表達(dá)的全基因組分析。與哺乳動物中這些技術(shù)的快速發(fā)展相比，植物中單細(xì)胞DNA甲基化的分析進(jìn)展要慢得多。雖然植物中的大多數(shù)單細(xì)胞研究都集中在轉(zhuǎn)錄組上，但有研究使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的隨機整合片段測序（BRIF-seq）揭示了玉米中4個四分體的16個微孢子的單細(xì)胞DNA甲基化組。WGBS結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選，已經(jīng)允許揭示特定細(xì)胞類型的DNA甲基化組，包括6種不同的根分生組織細(xì)胞群、精子和營養(yǎng)細(xì)胞、莖和非莖的芽分生組織細(xì)胞。這些研究揭示了植物細(xì)胞的異質(zhì)性和不同細(xì)胞類型中DNA甲基化的動態(tài)變化。 DNA甲基化可塑性 擬南芥品系Col-0的DNA甲基化變化 在個體水平上，DNA甲基化動態(tài)變化，并且可以在來自同一祖先的植物代際間變化，也可以在不同實驗室中同一植物的不同組織以及來自相同組織的細(xì)胞之間變化。不同實驗室中Col-0基因組DNA甲基化水平差異在CG中高達(dá)10%、在非CG甲基化區(qū)域達(dá)到7%。DNA甲基化模式表現(xiàn)出與上下文（CG、CHG、CHH）背景差異，在發(fā)育的各個階段觀察到CG甲基化穩(wěn)定、CHG甲基化增加、CHH甲基化減少。且與發(fā)育相關(guān)的大多數(shù)甲基化變化發(fā)生在著絲粒轉(zhuǎn)座元件（TEs）中。 圖 2. DNA甲基化可塑性及其對植物適應(yīng)環(huán)境中的作用。 A. 來自不同實驗室的50個高質(zhì)量WGBS數(shù)據(jù)集的野生型(WT)擬南芥Col-0的全基因組平均CG和CHG甲基化水平。 B. 通過比較4種組織的DNA甲基化數(shù)據(jù)鑒定的CG DMCs分布。 C. 來自9種根細(xì)胞類型的100 kb窗口中CG、CHG和CHH甲基化水平的主成分分析(PCA)。RT，根尖；EP，表皮；CO，皮層；EN，內(nèi)皮層；ST，髓；CRC，柱狀根帽；LC，下柱狀。 D. DNA甲基化對植物對免疫啟動的敏感性。 E. IAA27的DNA甲基化變化與CLSY1的基因突變相結(jié)合，影響側(cè)根發(fā)育并賦予其對低鉀環(huán)境的適應(yīng)。"T"形實線表示DNA甲基化增加抑制IAA27表達(dá)。"T"形虛線表示IAA27表達(dá)負(fù)調(diào)控側(cè)根發(fā)育，較粗線條表示更高表達(dá)抑制作用更強。 F. 在暴露于UVB后，UVR8-DRM2模塊誘導(dǎo)的DNA甲基化減少激活了下游基因/TEs。虛線框表示UVR8和DRM2之間的物理作用位點。"T"形實線表示抑制了DRM2介導(dǎo)的DNA甲基化，較粗線條具有更強抑制作用。 相比之下，組織（如根和莖）之間的甲基化模式差異呈動態(tài)變化，其中在常染色質(zhì)區(qū)域的CG甲基化和著絲粒區(qū)域的非CG甲基化變化具有差異。這種表觀基因組的可塑性主要歸因于自發(fā)的表觀遺傳變化。與基因突變相比，表觀遺傳變化的發(fā)生率高得多，且在擬南芥基因組中已經(jīng)鑒定出表觀遺傳突變熱點區(qū)域。盡管這些區(qū)域只占基因組中CG位點的約12%，但在這些熱點區(qū)域觀察到約63%的表觀遺傳突變事件。甲基化模式差異的另一個重要因子是甲基化機制的組織/細(xì)胞特異性表達(dá)。已知有十個基因參與表觀遺傳調(diào)控，包括DNA甲基化減少1（DDM1）、ARGONAUTE 9（AGO9）和SU(VAR)3-9同源物4（SUVH4），這些基因在干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。CLASSY家族基因表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式；這些蛋白以組織特異性方式調(diào)控24-nt siRNA產(chǎn)生和DNA甲基化?；钚訢NA去甲基化是組織間差異性甲基化的另一因素，擬南芥DNA去甲基化由4個DEMETER家族成員-DME、DML2、DML3和ROS1調(diào)控，野生型中鑒定出的許多組織特異性甲基化變化在這4個基因的四重突變體中都不存在。 響應(yīng)環(huán)境的DNA甲基化變化 越來越多的研究表明，DNA甲基化作為一種可遺傳的胞嘧啶修飾，能夠響應(yīng)并適應(yīng)各種生物和非生物脅迫。本文重點描述DNA甲基化在植物適應(yīng)生物和非生物脅迫中重要作用的新研究。 雖然基因突變賦予了植物長期適應(yīng)性，但DNA甲基化可以快速響應(yīng)環(huán)境挑戰(zhàn)并迅速提高適應(yīng)度。Sheikh等人（2023年）發(fā)現(xiàn)了接頭組蛋白H1和DNA甲基化在植物防御中的重要作用。由于植物防御基因表達(dá)變化，一個含有3種組蛋白H1變體（h1.1、h1.2、h1.3）的擬南芥三重突變體表現(xiàn)出對植物病原體感染抗性增強。在病原體感染之前使用22-氨基酸鞭毛蛋白（flg22）進(jìn)行預(yù)處理的啟動過程增強了野生型植物對隨后病原體感染抗性。然而h1突變體對啟動不敏感。flg22處理導(dǎo)致h1防御基因啟動子中的DNA甲基化增加，從而導(dǎo)致其抑制。這項研究表明，DNA甲基化可以快速響應(yīng)病原體感染，并通過調(diào)控防御基因表達(dá)影響植物防御。 DNA甲基化也可以在長期進(jìn)化過程中增強植物的適應(yīng)性，無論是依賴或獨立于基因突變。Shahzad等人（2020年）研究表明，DNA甲基化變化與基因突變相結(jié)合，允許植物響應(yīng)鉀缺乏。對土壤中營養(yǎng)元素的感知和反應(yīng)對植物至關(guān)重要，必需營養(yǎng)素鉀的缺乏可能導(dǎo)致根系發(fā)育不良。不同的擬南芥品系已經(jīng)進(jìn)化出2種策略，通過增加主根或側(cè)根的生長來克服低鉀脅迫。Shahzad等人（2020年）使用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）鑒定出CLSY1作為低鉀條件下側(cè)根發(fā)育的調(diào)控因子。低鉀抑制了吲哚-3-乙酸誘導(dǎo)27（IAA27）的降解，IAA27通過生長素信號通路負(fù)向調(diào)控根分枝。同時CLSY1可以通過DNA甲基化沉默IAA27。在CLSY1的538位點上，天冬氨酸到谷氨酸變化與自然擬南芥品系中低鉀條件下側(cè)根發(fā)育相關(guān)。攜帶編碼天冬氨酸的CLSY1等位基因品系在IAA27啟動子上的DNA甲基化水平增加，與攜帶編碼谷氨酸的等位基因品系相比，IAA27表達(dá)水平下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，DNA甲基化可以協(xié)調(diào)遺傳變化，并促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，使植物能夠克服具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境。 盡管DNA甲基化已被認(rèn)為與植物適應(yīng)有關(guān)，但證據(jù)大多來自顯示DNA甲基化變化與環(huán)境變化相關(guān)的研究。Jiang等人（2021年）提供了直接證據(jù)來說明紫外線照射如何抑制DNA甲基化。擬南芥中的DNA甲基化通過UVB光響應(yīng)，主要通過UV RESISTANCE LOCUS 8（UVR8，一種UVB光受體）和DRM2（一種新的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）之間的物理互作實現(xiàn)。UVB照射通過UVR8依賴性通路誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化并解除轉(zhuǎn)座元件（TEs）抑制。這種UVR8-DRM2介導(dǎo)的TEs重新激活機制可能直接或間接調(diào)控參與植物抵御紫外線照射的關(guān)鍵基因表達(dá)。 自然群體中DNA甲基化變化的遺傳基礎(chǔ) 對特定基因組位點以及不同擬南芥品系的全基因組甲基化組的研究顯示，自然品系間的DNA甲基化存在差異。與在個別品系中已充分描述的DNA甲基化建立和維持的調(diào)控因子相比，自然品系間DNA甲基化變化的遺傳和分子機制了解甚少。GWAS已經(jīng)鑒定出此過程的多個影響因子，其中CMT2因全基因組非CG甲基化水平、差異甲基化區(qū)域（DMRs）和CMT2靶向的轉(zhuǎn)座元件（TEs）被多個GWAS定位。這與CMT2作為負(fù)責(zé)維持CHH甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能以及CHH和CHG甲基化之間的強相關(guān)性相吻合。另一個TEs上CHH甲基化的主要決定因子是NRPE1，它編碼RNA聚合酶V的大亞基，是RNA介導(dǎo)DNA甲基化（RdDM）通路的關(guān)鍵組分。NRPE1在調(diào)控TEs移動性方面的作用也通過GWAS揭示。 在一項GWAS中，miR823A通常與CHG DMRs相關(guān)。將CHH甲基化作為協(xié)變量后，另一項RdDM/CMT2靶向TEs的CHG甲基化的GWAS鑒定出CMT3和miR823A。CMT3編碼負(fù)責(zé)維持CHG甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，而miR823A編碼的microRNA823A預(yù)計靶向CMT3。這些發(fā)現(xiàn)表明miR823A-CMT3模塊介導(dǎo)的CHG甲基化調(diào)控可能，但還需要進(jìn)一步驗證。 包括AGO9和AGO1在內(nèi)的ARGONAUTE基因被鑒定為自然群體中RdDM靶向TEs的CHH甲基化調(diào)控因子。這些基因在這些品系中的功能可能與Col-0中AGO9功能不同，因為ago9突變體在RdDM靶向的低甲基化區(qū)域（hypo-DMR）的甲基化沒有變化。這表明在Col-0中沒有參與RdDM通路的AGO蛋白可能在其他品系中參與DNA甲基化。 MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1（MSI1）編碼Polycomb抑制復(fù)合體2（PRC2）的一個亞基，該亞基催化組蛋白3賴氨酸27位點的三甲基化（H3K27me3）。在兩項的GWAS中，MSI1與44個DMR區(qū)域的CHG甲基化以及RdDM和CMT2靶向的TEs相關(guān)。在Col-0背景下，H3K27me3與DNA甲基化無關(guān)，與CMT3對CHG甲基化所必需的H3K9me2不同。這些發(fā)現(xiàn)表明在其他品系中DNA甲基化和H3K27me3之間可能存在相關(guān)性，這有待進(jìn)一步表征。 盡管沒有被重復(fù)鑒定，JUMONJI26（JMJ26）-BONSAI METHYLATION 1（IBM1）的同源物基因突變被報告與使用CHH作為協(xié)變量的條件GWAS中RdDM靶向TEs的CHG甲基化相關(guān)聯(lián)。敲除JMJ26導(dǎo)致RdDM靶向TEs的CHG甲基化增加。鑒定JMJ26的關(guān)鍵是在CHG甲基化的GWAS時將CHH甲基化作為協(xié)變量的條件分析。這一發(fā)現(xiàn)突出了GWAS在群體表觀遺傳學(xué)研究中的創(chuàng)新潛力，包括研究方法或群體構(gòu)建。 除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，大量的基因突變，無論是鄰近還是遠(yuǎn)端，已被證明與靶位點的DNA甲基化變化相關(guān)聯(lián)。盡管如此，關(guān)于這些關(guān)聯(lián)背后的因果基因突變知之甚少，因為還沒有驗證這些關(guān)聯(lián)背后的遺傳變化。一些研究表明，諸如TE插入和結(jié)構(gòu)變異（SVs）的基因突變可以影響附近位點的DNA甲基化。Ahmed等人（2011年）發(fā)現(xiàn)，沒有匹配24-nt siRNA的數(shù)百個TEs通過鄰近密集甲基化的TEs甲基化擴散獲得DNA甲基化。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在211個擬南芥品系中，近一半的新TE插入位點在帶有TE插入的品系中高度甲基化并擴散到鄰近區(qū)域。直接證據(jù)來自CEN180重復(fù)序列在常染色質(zhì)靶位點的從頭沉積，從而在ibm1突變體中誘導(dǎo)局部DNA甲基化的建立和擴散。在擬南芥1001個甲基化組中，大部分SVs（22%至50%）的甲基化存在差異，表明了SV對鄰近序列DNA甲基化的影響。SV如何影響DNA甲基化的好例子是擬南芥中的PHOSPHORIBOSYLANTHRANILATE ISOMERASE（PAI）基因家族（PAI1至PAI4），一些品系包含未甲基化的PAI基因，如Col，而其他品系包含甲基化的PAI基因，如WS。Col包含3個不連鎖的PAI基因（PAI1、PAI2和PAI3），而WS包含4個PAI基因，具有PAI1至PAI4的倒置重復(fù)。這個倒置重復(fù)導(dǎo)致所有4個PAI基因甲基化。 易小結(jié) 全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWASs)為理解轉(zhuǎn)座元件(TEs)非CG甲基化的自然變異的遺傳基礎(chǔ)提供了重要信息。然而目前對CG甲基化的遺傳基礎(chǔ)以及其他基因組特征（如啟動子區(qū)域和蛋白質(zhì)編碼基因）的DNA甲基化了解仍然知之甚少。高通量檢測和驗證表觀遺傳變化的功能，以及將這些變化在作物育種項目中的應(yīng)用，是未來重要的研究工作。在群體水平上的包含多組學(xué)數(shù)據(jù)集的全基因組染色質(zhì)圖譜的可用性，無疑將加深對表觀遺傳變化的理解。結(jié)合大數(shù)據(jù)分析與表觀遺傳編輯技術(shù)，用于挖掘和應(yīng)用表觀遺傳變化，將極大增強作物育種項目。
