CRISPR-Cas12a表現(xiàn)出金屬依賴的特異性

Cas12a是V-A型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的效應蛋白，其特異性由于潛在的脫靶效應一直是體外和基因組編輯實驗中廣泛研究的主題。先前的一些報道指出，Cas12a的特異性有可能在生理條件下發(fā)生改變。特別是，細胞中游離鎂離子的濃度通常會低于體外研究中鎂離子使用的濃度。對此，研究人員們期望做出進一步研究以了解這種情況下的Cas12a特異性的差異。美國愛荷華州立大學的研究人員在Nuleic Acids Research 期刊上發(fā)表名為CRISPR-Cas12a exhibits me[x]tal-dependent specificity switching的論文，該研究揭示了Cas12a表現(xiàn)出金屬依賴的特異性轉(zhuǎn)換的結(jié)果。

       Cas12a的特異性是由crRNA和DNA靶標之間的互補性、DNA靶標旁邊的原間隔短回文序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）兩個主要因素決定。盡管Cas12a的特異性已經(jīng)被廣泛研究，但許多體外研究是在高鎂離子濃度下進行的，這可能與細胞內(nèi)實際的游離Mg2+濃度不一致。為了解決這個疑惑，研究人員通過在一系列Mg2+濃度下對Cas12a同源物的特異性進行分析。研究結(jié)果顯示，Cas12a會根據(jù)金屬離子濃度改變其特異性，在低Mg2+濃度下，Cas12a對種子區(qū)域的錯配容忍度更高，而對PAM遠端錯配的容忍度則降低。

一、Mg2+濃度影響脫靶和Cas12a的反式切割

       先前的研究指出噬菌體通過在PAM和種子區(qū)域產(chǎn)生突變來逃避CRISPR介導的免疫反應。然而，研究人員卻觀察到PAM遠端區(qū)域的多個錯配也能使噬菌體優(yōu)先從Cas12a中逃逸。通過頭對頭競爭試驗，他們發(fā)現(xiàn)了不同類型的噬菌體突變體根據(jù)crRNA的匹配程度會呈現(xiàn)出不同的種群分布模式。具體來說，使用完全匹配的crRNA時，種子突變體占優(yōu)勢；而使用遠端不匹配的crRNA時，遠端突變體開始占優(yōu)勢。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)在低MgCl2濃度下（1 mM），種子突變體的切割速度比遠端突變體快很多，這與在高MgCl2濃度（10 mM）下的情況相反。

       為了進一步分析了Cas12a在不同Mg2+濃度下的特異性，研究人員通過體外質(zhì)粒文庫進行了切割實驗。實驗中使用了Cas12a-crRNA-蛋白復合物來切割含有突變靶序列的質(zhì)粒文庫，并在不同時間點收集樣本，通過瓊脂糖凝膠電泳分離并分析切割結(jié)果。實驗結(jié)果顯示，不同Mg2+濃度下，Cas12a對種子區(qū)域突變的容忍度不同，低Mg2+濃度下容忍度更高，而對PAM遠端區(qū)域突變的容忍度則降低。

       此外，Cas12a被目標序列激活的非特異性DNA切割活性在高Mg2+濃度下，但在低Mg2+濃度下減弱。這些試驗結(jié)果表明，Cas12a的特異性和非特異性切割活性都受到Mg2+濃度的影響。

二、PAM-近端和遠端突變體受到Mg2+濃度的不同影響

       為了了解Mg2+濃度如何影響Cas12a對不同類型的突變體上的識別和切割，研究人員通過火山圖和熱圖等分析工具做了進一步的研究。通過火山圖的分析，研究人員比較了在1 mM和10 mM MgCl2條件下，Cas12a切割未切割（uncleaved）或缺口（nicked）的序列?；鹕綀D顯示，PAM或種子區(qū)域的第一個突變在高MgCl2濃度下更可能未被切割，而中間或PAM遠端區(qū)域的第一個或第二個突變在低MgCl2濃度下更可能未被切割或形成缺口。熱圖分析則進一步表明在不同Mg2+濃度下，各種突變序列在未切割和缺口分數(shù)中的豐度。

       此外，研究人員還探討了Cas12a缺口切割（nicking）的機制，發(fā)現(xiàn)在高Mg2+濃度下，特定位置的突變組合導致缺口切割，而在低Mg2+濃度下，中間或PAM遠端區(qū)域的至少一個突變導致缺口切割。對Cas12a酶的金屬離子依賴性進行實驗，其結(jié)果表明Cas12a的第二鏈切割步驟在低Mg2+濃度下受到影響，尤其是對于AsCas12a，這表明Cas12a的切割活性具有金屬離子依賴性。這些研究結(jié)果揭示了Mg2+濃度的變化對Cas12a的特異性有影響，在低Mg2+濃度下，Cas12a對PAM近端的突變更加寬容，而對PAM遠端的突變則寬容度降低。

三、可視化金屬依賴的特異性開關(guān)

       為了更直觀展示Mg2+對Cas12a特異性的影響，研究人員進一步通過實驗方法來觀察和量化Cas12a在不同金屬離子濃度下特異性的變化，并以圖表形式展示。他們設(shè)置了兩種時間點（1分鐘和30分鐘）來觀察Cas12a在不同Mg2+濃度下的切割效率，并通過凝膠電泳分離未切割（負超螺旋）、單鏈切割（nicked）和完全切割（linear）的DNA。通過計算每個突變序列在不同Mg2+濃度下未切割或單鏈切割的分數(shù)，作者能夠估算出DNA完全切割的比例。利用這些數(shù)據(jù)，研究人員創(chuàng)建了火山圖（volcano plots）和熱圖（heatmaps），這些圖表可視化了Mg2+濃度變化對Cas12a切割特異性的影響，揭示了在低Mg2+濃度下，特定突變類型的序列在未切割或單鏈切割的分數(shù)中的變化。

四、Mg2+依賴的特異性轉(zhuǎn)換的不同機制

       為了探討Mg2+如何根據(jù)不同的突變位置以不同的方式影響Cas12a的特異性，研究人員作者進一步研究了FnCas12a并通過兩種不同的方式啟動切割反應來分析切割機制，分別是在存在Mg2+的情況下將RNP與DNA混合和在沒有Mg2+的情況下先混合RNP和DNA，然后通過添加Mg2+來啟動切割。研究結(jié)果顯示，當切割反應通過添加Mg2+來啟動時，完全匹配和種子突變目標的第一鏈切割在7秒內(nèi)完成，而PAM遠端突變目標在10 mM Mg2+下也顯示出快速的第一鏈切割，但在1 mM Mg2+下則顯示出降低的切割速率。

       此外，研究人員還測定不同條件下切割反應的速率常數(shù)，以評估切割步驟的速率限制，其結(jié)果表明對于種子突變目標，DNA結(jié)合是速率限制步驟，而在低Mg2+濃度下，PAM遠端突變目標的切割缺陷可能是在DNA結(jié)合后但在每條鏈切割前的步驟中變慢，這可能是由于必需的構(gòu)象變化被抑制。

五、噬菌體逃逸結(jié)果揭示了Cas12a同源物特異性的后果

       研究人員發(fā)現(xiàn)不同Cas12a同源物（如AsCas12a、FnCas12a和LbCas12a）在低Mg2+濃度下的特異性存在差異，但 是這種特性異性在面對噬菌體挑戰(zhàn)時如何影響噬菌體逃逸還未清楚。為此，研究人員通過在大腸桿菌中表達不同的Cas12a同源物和crRNA，然后感染λ噬菌體的實驗。從AsCas12a和FnCas12a處理的培養(yǎng)物中他們發(fā)現(xiàn)了噬菌體逃逸突變體，其中AsCas12a處理的噬菌體群體顯示出高的突變多樣性，而Fn和LbCas12a處理的噬菌體群體則主要在PAM和種子區(qū)域的有害位置出現(xiàn)突變。此外，對噬菌體群體突變位置進行分析，其結(jié)果表明AsCas12a處理的噬菌體群體在PAM和種子區(qū)域出現(xiàn)了廣泛的突變，而Fn和LbCas12a處理的噬菌體群體則主要在種子區(qū)域的特定位置出現(xiàn)突變。

六、金屬依賴的特異性可以改變噬菌體逃逸的結(jié)果

       在獲得Cas12a酶的特異性受其同源物類型的影響的結(jié)果后，研究人員進一步探討金屬離子濃度如何影響這種特異性和噬菌體逃逸的結(jié)果。研究人員在補充了不同Mg2+濃度的培養(yǎng)基中重復了噬菌體競爭實驗，發(fā)現(xiàn)在10 mM Mg2+條件下，PAM遠端突變噬菌體在幾乎所有培養(yǎng)物中占據(jù)了優(yōu)勢，而在150 mM Mg2+條件下，PAM遠端突變噬菌體的優(yōu)勢地位降低。這些結(jié)果表明，細胞內(nèi)Mg2+濃度的變化可以影響噬菌體逃逸的結(jié)果，低Mg2+濃度下Cas12a對種子突變的容忍度更高，而對PAM遠端突變的容忍度降低。

   綜上所述，研究人員通過系列試驗研究了CRISPR-Cas12a酶在不同金屬Mg2+離子濃度下的特異性變化，并探討了這些變化對噬菌體逃逸和基因組編輯的影響。研究結(jié)果表明Cas12a根據(jù)金屬離子濃度改變其特異性，降低Mg2+濃度降低了種子錯配引起的裂解缺陷，而增加了PAM遠端錯配引起的缺陷。不同Cas12a同源物在不同鎂離子濃度下的特異性差異，它們處理的噬菌體群體中出現(xiàn)的突變類型和多樣性存在差異，這種差異改變了噬菌體逃逸的結(jié)果。該研究對于理解和優(yōu)化CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因組編輯中的應用具有重要意義。