7種基于TCR療法的分子結(jié)構(gòu)

T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合體是一種天然產(chǎn)生的抗原傳感器，它檢測(cè)、放大和協(xié)調(diào)細(xì)胞對(duì)來自細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白的表位的免疫反應(yīng)。TCR能夠靶向腫瘤細(xì)胞選擇性表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括新抗原、癌胚抗原和病毒癌蛋白。因此，TCR為新興的腫瘤治療提供了基礎(chǔ)。在這里，介紹目前使用TCRs和TCR-like分子治療腫瘤的前景。這包括表達(dá)內(nèi)源性或工程TCR的T細(xì)胞過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移、TCR雙特異性結(jié)合分子和HLA結(jié)合多肽的特異性抗體(TCR mimic)。

與細(xì)胞表面和可溶性表位生理結(jié)合的抗體不同，TCRs可以對(duì)來自整個(gè)癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組的抗原做出反應(yīng)。這包括約88%的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)只存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體等細(xì)胞內(nèi)。TCR結(jié)合細(xì)胞內(nèi)抗原的獨(dú)特能力，這一特性極大地?cái)U(kuò)大了可操作的免疫靶點(diǎn)的范圍，源于它們不與完整蛋白質(zhì)結(jié)合的事實(shí)。相反，它們識(shí)別結(jié)合到HLA分子上的蛋白降解多肽，這些多肽已經(jīng)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面用于細(xì)胞外呈遞。

TCR對(duì)配體具有很高的靈敏度。腫瘤細(xì)胞表面特異性多肽/HLA(p/HLA)復(fù)合體的數(shù)量通常在1-100個(gè)分子范圍內(nèi)。這個(gè)數(shù)值比治療抗體所需的分子數(shù)小幾個(gè)數(shù)量級(jí)。然而，只有1-3個(gè)p/HLA復(fù)合體足以觸發(fā)T細(xì)胞效應(yīng)功能。同時(shí)，TCR具有的特異性，可以區(qū)分不同于單一氨基酸的多肽，例如由體細(xì)胞點(diǎn)突變或生殖系多態(tài)引起的多肽，以及相同氨基酸的不同立體異構(gòu)體。

盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，第一個(gè)TCR療法(Tebentafusp)直到2021年才進(jìn)入腫瘤治療的標(biāo)準(zhǔn)。相比之下，抗體及其衍生物，包括抗體-藥物結(jié)合物(ADC)、雙特異性蛋白和CAR修飾的T細(xì)胞，自1990s年代中期以來一直是癌癥治療的主要手段。這里介紹了天然產(chǎn)生的TCR的結(jié)構(gòu)，并討論了合理修改TCR的不同結(jié)構(gòu)域以創(chuàng)造具有不同生化、功能和藥理特性的受體的策略。

7種基于TCR療法的分子結(jié)構(gòu)

內(nèi)源性TCR

TCR不是一個(gè)單一的分子，它是一個(gè)蛋白質(zhì)的復(fù)合體，其中抗原識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能被劃分為不同的亞基。TCR的功能單元是由六個(gè)蛋白質(zhì)組成的八聚體復(fù)合體：克隆型TCRα/TCRβ半鏈和不變的CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ鏈(圖1a)。這些蛋白質(zhì)按1：1：1：1的化學(xué)計(jì)量比組裝，其二聚體亞基為TCRαβ：CD3δε：CD3γε：CD3ζζ。少數(shù)循環(huán)T細(xì)胞(γδT細(xì)胞)表達(dá)TCRγδ，而不表達(dá)TCRαβ。TCR半鏈蛋白都不具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，相反，受體依賴于與CD3分子的非共價(jià)相互作用來啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞、T細(xì)胞激活和細(xì)胞命運(yùn)決定。CD3γ、CD3δ和CD3ε亞基是遺傳相關(guān)的，只有一個(gè)免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)，而CD3ζ亞基是遺傳無關(guān)的，包含三個(gè)ITAMs。

在結(jié)構(gòu)上，每個(gè)TCR半鏈由一個(gè)可變(V)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)恒定(C)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短的細(xì)胞質(zhì)尾組成。TCR多樣性和特異性是通過涉及Vα/Vβ結(jié)構(gòu)域的組合和連接多樣性產(chǎn)生的。與免疫球蛋白可變重鏈(VH)類似，TCRVβ結(jié)構(gòu)域的組合多樣性是由胚系編碼的V、多樣性(D)和連接(J)基因片段組成的。Vα結(jié)構(gòu)域類似于免疫球蛋白可變輕鏈(VL)，由鏈特異的V和J基因序列重組形成。重組的Vα和Vβ序列依次連接到Cα結(jié)構(gòu)域(由TRAC編碼)和兩個(gè)Cβ結(jié)構(gòu)域之一(由TRBC1和TRBC2編碼)。額外的組合多樣性來自重組TCRα和TCRβ半鏈的配對(duì)，這兩個(gè)TCR半鏈通過位于Cα和Cβ結(jié)構(gòu)域上保守的半胱氨酸殘基形成的一個(gè)二硫鍵共價(jià)連接。

每個(gè)TCR異源二聚體包含6個(gè)序列超變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)。CDR是從TCR的可變區(qū)伸出的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，形成與p/HLA復(fù)合體的主要接觸部位。在CDR之間，每個(gè)可變鏈都有3個(gè)框架區(qū)域，促進(jìn)Vα/Vβ結(jié)構(gòu)域的鏈間堆積和Vα/Cα和Vβ/Cβ結(jié)構(gòu)域的鏈內(nèi)界面。CDR1和CDR2環(huán)位于TCR暴露于溶劑的末端的外圍，并且是胚系編碼的。相反，CDR3環(huán)位于中央，并通過組合和連接多樣化產(chǎn)生，以創(chuàng)建每個(gè)TCR多態(tài)的序列。除了不同V(D)J基因片段的并置外，CDR3環(huán)中的額外多樣性是通過刪除和添加非模板編碼的核苷酸而產(chǎn)生的。

大多數(shù)TCR對(duì)角對(duì)接在p/HLA復(fù)合體上，將Vα和Vβ結(jié)構(gòu)域分別放置在與HLA結(jié)合的多肽的氨基末端和羧基末端。這種配置在TCR和p/HLA復(fù)合體之間建立了廣泛的接口。此外，它將TCR序列多樣性大的區(qū)域（體細(xì)胞重排的CDR3環(huán)）定位在多肽的中央核心上，在那里它們有助于受體的良好特異性。相反，胚系編碼的CDR1環(huán)和CDR2環(huán)主要(盡管不是排他性的)接觸定義HLA分子結(jié)合槽的兩個(gè)α螺旋。這些相互作用確保TCR以肽依賴的方式識(shí)別p/HLA復(fù)合體。大多數(shù)天然存在的TCR具有相對(duì)較弱的結(jié)合親和力，典型的解離常數(shù)(Kd)測(cè)量在微摩爾范圍內(nèi)。相比之下，成熟抗體的親和力一般在納摩爾到皮摩爾之間。

外源TCR與基因組編輯

原代人類T細(xì)胞的特異性可以通過表達(dá)外源TCRαβ基因序列而被基因重定向以識(shí)別腫瘤細(xì)胞所顯示的p/HLA復(fù)合體(圖1b)。到目前為止，整合逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體是常見的將外源TCRs引入臨床應(yīng)用的方法。然而，非病毒基因組整合技術(shù)也可以使用，包括睡美人轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)和CRISPR-Cas9。盡管有廣泛的安全記錄，但整合病毒載體具有一定的局限性。病毒以半隨機(jī)方式整合，拷貝數(shù)可變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)異質(zhì)性。此外，病毒的制造成本很高，可導(dǎo)致插入突變，并且具有相對(duì)有限的載貨能力。整合病毒載體使內(nèi)源TCR半鏈保持不變，這除了正確配對(duì)的內(nèi)源性(α/β)和外源性(α′/β′) TCR之外，這還會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤配對(duì)的(α′/β，α/β′)異二聚體。內(nèi)源性和錯(cuò)配TCR的表達(dá)可能會(huì)通過競(jìng)爭有限的信號(hào)分子池而影響治療效果。此外，由于錯(cuò)配的TCR沒有經(jīng)過胸腺選擇，它們可以具有新的反應(yīng)性，包括對(duì)自身抗原的反應(yīng)。在同基因小鼠中，T細(xì)胞表達(dá)錯(cuò)配的TCRs會(huì)引發(fā)致死性移植物抗宿主病(GvHD)。幸運(yùn)的是，尚未在人類臨床試驗(yàn)中觀察到TCR錯(cuò)配導(dǎo)致的GvHD。

為了減少TCR錯(cuò)配，基于核酸酶的基因組編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子內(nèi)切酶和CRISPR-Cas9，可用于干擾內(nèi)源性TRAC和/或TRBC1/2基因座。然而，這些策略會(huì)導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂，從而有可能產(chǎn)生off-target的基因組效應(yīng)，包括插入/缺失和染色體易位。抑制性RNA可以在不引起雙鏈DNA斷裂的情況下沉默天然TCR的表達(dá)，但這種方法不能完全降低錯(cuò)配的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榍贸ǔＪ遣煌暾摹?/span>DNA堿基編輯被開發(fā)出來，它通過剪接位點(diǎn)失活或引入過早終止密碼子來擾亂蛋白質(zhì)的表達(dá)，而不會(huì)導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂。使用DNA堿基編輯對(duì)TRAC和TRBC1/2基因座進(jìn)行操作可能為內(nèi)源性TCR的基因去除提供一種的替代方法。

除了干擾內(nèi)源TCR外，CRISPR-Cas9還可能通過模板引導(dǎo)的同源定向修復(fù)促進(jìn)外源TCRαβ基因在TRAC基因座的靶向基因組整合。與半隨機(jī)插入到基因組中的TCR相比，靶向整合同時(shí)提供了增強(qiáng)的功能和更可預(yù)測(cè)的安全性。靶向整合利用基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了生理抗原受體的調(diào)節(jié)，這一特征可以防止免疫衰竭。重要的是，使用CRISPR-Cas9的靶向敲入可以通過共電穿孔Cas9 RNP和DNA同源定向修復(fù)模板以非病毒的方式執(zhí)行。這一創(chuàng)新極大地減少了生成臨床使用的TCR結(jié)構(gòu)所需的時(shí)間和成本。非病毒TCR整合歷來不如病毒方法有效。工藝改進(jìn)可能會(huì)提高編輯率，包括單鏈DNA供體模板、納米質(zhì)粒、核內(nèi)模板穿梭、Cas9 RNP穩(wěn)定化和小分子雞尾酒。

結(jié)構(gòu)域工程

TCR結(jié)構(gòu)域工程是提高外源TCR效力和安全性的另一種方法。恒定結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的改變尤其多才多藝，因?yàn)樗鼈冞m用于不同的治療候選對(duì)象。例如，沿著Cα/Cβ界面放置額外的半胱氨酸殘基有助于創(chuàng)建第二個(gè)鏈間二硫鍵，從而增強(qiáng)適當(dāng)?shù)陌腈溑鋵?duì)。用全部或選定的氨基酸殘基鼠源化來代替人的Cα/Cβ序列也可以減少錯(cuò)配。盡管這種方法引入了潛在的免疫原性外源序列，但對(duì)接受帶有小鼠恒定區(qū)的TCR的患者的分析未能發(fā)現(xiàn)免疫原性、細(xì)胞持久性和臨床結(jié)果之間的相關(guān)性。如果細(xì)胞產(chǎn)品中不需要異源序列，則可以將人Cα/Cβ結(jié)構(gòu)域的倒置(結(jié)構(gòu)域交換)作為一種替代方法來大限度地減少錯(cuò)配。恒定鏈含有翻譯后糖基化的殘基，通過定點(diǎn)突變?nèi)コ腔稽c(diǎn)增強(qiáng)了外源TCR的功能親和力，可能是通過改善免疫突觸內(nèi)的TCR聚集。在TCRα的S跨膜結(jié)構(gòu)域中，用脂肪殘基替代非電離氨基酸可以增加TCR的表面表達(dá)。

對(duì)TCR可變區(qū)的修飾，包括框架和CDR區(qū)，也可以改善TCR的功能。與恒定和跨膜結(jié)構(gòu)域改變不同，這些改變需要經(jīng)驗(yàn)測(cè)試和優(yōu)化。具有相同恒定區(qū)的外源表達(dá)的TCR在細(xì)胞表面的表達(dá)并不相同，這一發(fā)現(xiàn)表明可變域有助于TCR的組裝和穩(wěn)定性。比較高表達(dá)和弱表達(dá)TCRs骨架區(qū)域的遞歸氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在可變區(qū)和恒定區(qū)的交界處有3個(gè)佳殘基。對(duì)于含有次優(yōu)殘基的TCRs，用佳氨基酸替代可增強(qiáng)表面表達(dá)和體內(nèi)抗腫瘤效果。重要的是，由于骨架區(qū)域不參與抗原結(jié)合，這些部位的變化不太可能改變TCR的交叉反應(yīng)特征。

對(duì)選定的CDR殘基進(jìn)行突變可以增強(qiáng)TCR的結(jié)合親和力。這可以通過經(jīng)驗(yàn)性測(cè)試或定向進(jìn)化技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。與天然序列相比，CDR1、CDR2或CDR3環(huán)的單一或組合替代可導(dǎo)致親和力增加多達(dá)100萬倍。除了調(diào)節(jié)結(jié)合親和力外，CDR序列的改變也可能改變TCR的特異性。兩項(xiàng)使用親和力增強(qiáng)受體的臨床試驗(yàn)已經(jīng)導(dǎo)致致命的off-tumor/off-target毒性，可歸因于TCR的交叉反應(yīng)譜的變化。因此，在臨床發(fā)展之前，有必要對(duì)親和力增強(qiáng)的TCR的交叉反應(yīng)譜進(jìn)行詳細(xì)的評(píng)估。盡管早期遭遇挫折，但許多目前處于臨床開發(fā)中的TCR療法已經(jīng)經(jīng)歷了親和力增強(qiáng)。一種策略借鑒了高度關(guān)注特異性的領(lǐng)域(如DNA結(jié)合和酶催化)，即設(shè)計(jì)具有更高特異性的TCRs。這種結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的方法不是改變親和力，而是尋求在TCR-p/HLA界面上重新分配有吸引力的相互作用，以減少off-target多肽識(shí)別。

proof-of-concept研究說明了捕獲結(jié)合工程如何在不改變結(jié)合親和力的情況下增加TCR效力。捕獲鍵是在受體解離之前，在剪切力條件下瞬間形成氫鍵和鹽橋而形成的。這會(huì)導(dǎo)致延長的鍵壽命，導(dǎo)致TCR信號(hào)和T細(xì)胞激活的增強(qiáng)。捕捉鍵工程可以通過將極性和帶電的氨基酸引入位于p/HLA表面附近但不直接接觸的CDR環(huán)來實(shí)現(xiàn)。這種方法的目標(biāo)是促進(jìn)在TCR與p/HLA復(fù)合體脫鉤期間產(chǎn)生有利的相互作用，類似于魚鉤與獵物的接觸。由于捕捉鍵工程TCR的親和力通常保持在生理范圍內(nèi)，因此這些受體的交叉反應(yīng)譜不應(yīng)改變，因?yàn)橹苯优c基態(tài)p/HLA復(fù)合體接觸的殘基保持不變。

可溶性雙特異性TCRs

TCRαβ異源二聚體可以表達(dá)為一種可溶性的單鏈重組蛋白，使不需要基因工程的現(xiàn)成試劑得以開發(fā)。可溶性TCR可與來自激動(dòng)性抗CD3ε抗體的單鏈可變區(qū)(scFv)融合，從而產(chǎn)生稱為“免疫動(dòng)員抗癌單抗”(ImmTAC)和“T細(xì)胞結(jié)合受體”(TCER)的雙特異性蛋白(圖1c)。ImmTACs和TCERs在多克隆T細(xì)胞和表達(dá)特定p/HLA復(fù)合體的靶細(xì)胞之間建立人工免疫突觸。然而，為了以穩(wěn)定的方式結(jié)合p/HLA復(fù)合體作為單體，CDR突變需要將TCR的結(jié)合親和力提高到皮摩爾范圍，這一值是天然產(chǎn)生的TCR的10^6倍。改變TCR的結(jié)合親和力到這個(gè)程度可能會(huì)導(dǎo)致抗原特異性的喪失。在極端情況下，這可能導(dǎo)致高度混雜的受體與特定的HLA分子結(jié)合，而不依賴于結(jié)合肽的序列。因此，必須仔細(xì)評(píng)估親和力增強(qiáng)的TCR的特異性，包括使用大量的抗原和不匹配的靶細(xì)胞。使用雙特異性TCR重定向的T細(xì)胞對(duì)表達(dá)少至10個(gè)p/HLA分子的靶細(xì)胞表現(xiàn)出抗原特異性的細(xì)胞溶解作用。與單抗(75kDa和150kDa)相比，ImmTAC的分子量較??；因此，它們需要反復(fù)輸注才能保持效力。延長血清半衰期，例如與修飾的IgG Fc分子融合，可能會(huì)克服這一限制。

TCR mimic

另一類雙特異性T細(xì)胞結(jié)合蛋白，稱為TCR mimic，使用兩個(gè)抗體來源的單鏈抗體，通過多肽接頭共價(jià)連接。一個(gè)scFv與癌細(xì)胞上的p/HLA分子表位結(jié)合，而另一個(gè)scFv與T