毛細(xì)胞白血病NGS檢出少見BRAF突變

毛細(xì)胞白血?。?/span>HCL）的診斷基于外周血和/或骨髓中循環(huán)異常毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)，基于CD11c、CD25、CD103和CD123表達(dá)的HCL免疫學(xué)評分為3或4，以及B-raf原癌基因（BRAF基因）（7q34）存在BRAF V600E激活突變。124例HCL患者進(jìn)行了NGS檢測（靶向21基因），識別了一組 [ 6/124（2%）] 攜帶少見BRAF突變的患者：2例患者攜帶非V600突變（分別為BRAF F595L和BRAF W604L），另外4例患者攜帶BRAF沉默突變。微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）顯示，在同時攜帶BRAF V600E和沉默突變的4例患者中，3例為陰性。這些突變在HCL發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待闡明。在ddPCR顯示BRAF V600E陰性的情況下，BRAF測序是有必要的。

研究背景

毛細(xì)胞白血?。?/span>HCL）在1958年得到描述，是一種定義明確的疾病。診斷基于循環(huán)異常毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)證據(jù)，基于CD11c、CD25、CD103和CD123表達(dá)的HCL免疫學(xué)評分為3或4，以及B-raf原癌基因存在BRAFV600E激活突變。骨髓活檢和免疫組化有助于（鑒別）診斷，尤其是膜聯(lián)蛋白A1陽性。在實體瘤（惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌或非小細(xì)胞肺癌）患者中發(fā)現(xiàn)的不同BRAF突變主要位于BRAF外顯子11或15。報告了三個BRAF突變亞組：BRAF V600突變，包括BRAF V600E/K和除V600E/K以外的V600突變，以及非V600突變。

研究結(jié)果

我們報告了BRAF F595L突變的HCL患者。該患者（UPN-50）為一名57歲男性，2011年9月住院，表現(xiàn)為中度脾大，無外周淋巴結(jié)受累。血細(xì)胞計數(shù)顯示血小板減少（血小板計數(shù)：87×109/L）、單核細(xì)胞減少（<0.01×109/L）、中度淋巴細(xì)胞增多（6.20×109/L），無貧血（13.4g/dL）和中性粒細(xì)胞減少（2.79×109/L）。外周血涂片分析發(fā)現(xiàn)33%的典型毛細(xì)胞（2.97×109/L），外周血流式細(xì)胞術(shù)分析（密度梯度離心法分離單核細(xì)胞）顯示克隆性B細(xì)胞增殖（評估為白細(xì)胞總數(shù)的42%），CD20bright，CD79bbright，具有kappa輕鏈限制。CD5、CD10和CD38陰性。HCL的四種特異性標(biāo)記物（CD11c，CD25，CD103和CD123）陽性。未進(jìn)行骨髓活檢，未進(jìn)行膜聯(lián)蛋白A1染色。然而，典型毛細(xì)胞的骨髓浸潤以及外周血和骨髓免疫表型分析足以建立HCL的診斷。未檢測到激活錯義突變BRAF V600E，但檢測到BRAF F595L（c.1783T>C）突變，豐度（VAF）為33%。BRAF合子性拷貝數(shù)分析顯示沒有差異，提示沒有雜合性缺失。還檢測到兩個Krüppel樣因子-2（KLF2；19p13）突變。免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因（IGHV）突變（95.7%），具有VH3-7重排?；颊呓邮芰丝死鼮I（CDA）單藥治療，但在8.5年后的2020年6月復(fù)發(fā)，外周血中有5.7%的典型毛細(xì)胞。仍然檢測到BRAF F595L（VAF = 4.2%）和KLF2突變。進(jìn)一步測序未發(fā)現(xiàn)RAS（KRAS，NRAS）突變。考慮到該突變少見，以及對激酶活性程度的功能結(jié)果的懷疑，患者接受CDA單藥治療。達(dá)到完全緩解（CR），2023年6月仍處于CR狀態(tài)且無癥狀。

第二例患者（UPN-142）在同一等位基因上同時檢測到BRAF V600E和BRAF W604L突變。BRAF W604L突變在實體瘤（肺腺癌，惡性黑色素瘤或結(jié)直腸癌）中很少有報告，在健康個體（UCSC，gnomAD和ExAc數(shù)據(jù)庫）和HCL中從未報告過?；颊?/span>39歲，出現(xiàn)胃腸道感染和發(fā)熱，顯示全血細(xì)胞減少癥，于2021年7月就血液科就診?；颊呶闯霈F(xiàn)肝脾腫大或外周淋巴結(jié)受累。血細(xì)胞計數(shù)顯示血小板減少（血小板計數(shù)：100×109/L），單核細(xì)胞減少（0.05×109/L），貧血（11.3g/dL），中性粒細(xì)胞減少（1.18×109/L），淋巴細(xì)胞計數(shù)正常（3.36×109/L）。外周血單核細(xì)胞（PBMC）流式細(xì)胞術(shù)分析顯示克隆性B細(xì)胞增殖（評估為白細(xì)胞的22%），CD20bright，CD79bbright，具有kappa輕鏈限制。CD5、CD10和CD38陰性。HCL特異性標(biāo)志物（CD11c，CD25，CD103和CD123）陽性。進(jìn)行CDA聯(lián)合利妥昔單抗一線治療，達(dá)到CR，一次隨訪仍處于CR狀態(tài)，已持續(xù)12個月。

在4例患者中發(fā)現(xiàn)BRAF沉默突變，位于598和596位點。有趣的是，所有BRAF同義突變都與BRAF V600E突變位于同一等位基因且兩者VAF相似。進(jìn)行BRAF V600E ddPCR檢測，在4例同時攜帶BRAF V600E和沉默突變的患者中，3例為陰性（表1）。這3例患者攜帶c.1788T>C（p.G596=）或c.1794T>A（p.A598=）。由于兩個突變存在于同一等位基因上，雜交可能被改變了，解釋了假陰性結(jié)果。與c.1794T>A（p.A598=）不同，c.1794T>C（p.A598=）突變似乎不會損害檢測。如果BRAF V600E ddPCR呈陰性，應(yīng)對BRAF外顯子11和15進(jìn)行廣泛測序，以檢測其他BRAF突變。

討 論 

BRAF V600E突變是HCL的分子標(biāo)志。據(jù)報道，高達(dá)5%的HCL患者未見BRAF V600E突變。在這些患者中，應(yīng)排除BRAF非V600E突變的可能性。基于不同突變的激酶活性、RAS依賴性和二聚化譜，將BRAF突變分為三類。I類（如BRAF V600E）具有高激酶活性，氨基酸V600突變，RAS非依賴性，需要BRAF單體。II類（L597P/Q/R/S，K601E等）也是RAS非依賴性，具有高或中等激酶活性，需要BRAF二聚體。III類（A598V等）激酶活性受損，但由于RAS結(jié)合和CRAF激活增強，保持MAPK通路信號傳導(dǎo)增加。一項研究分析了22個突變，7個被歸類為I類，11個被歸類為II類，4個被歸類為III類。在一項包括1027例實體瘤的研究中，135例患者（7.6%）存在BRAF突變，其中101/135激酶激活，15%激酶受損（20/135），10%激酶未知（14/135）。正如預(yù)期的那樣，常見的突變是BRAF V600E，發(fā)生率為64%（86/135），但未報告有患者存在BRAF F595L。常見的激酶受損III類突變涉及密碼子594，在11%的患者（15/135）中觀察到，特別是D594E/G/H或D594N突變。與BRAF V600E突變相反，這些突變可能與RAS激活突變有關(guān)。使用適當(dāng)?shù)姆椒z測所有這些突變至關(guān)重要。一些BRAF突變可能對BRAF抑制劑不敏感，另一些可能對MEK抑制劑敏感。

先前僅報道了3例伴有非V600突變的HCL患者：2例外顯子11（F468C，D449E）突變患者和1例同時攜帶BRAF V600E和BRAF S602T突變的患者。有組織細(xì)胞肉瘤患者報告了BRAF F595L突變，該突變破壞對催化至關(guān)重要的BRAF激酶結(jié)構(gòu)域D594F595G596基序。作者表明，該突變與中等激酶活性有關(guān)，與HRAS Q61共存促進(jìn)致癌信號。BRAF外顯子15 F595L突變的HCL患者對CDA單一療法有反應(yīng)。另外注意，該患者不存在任何相關(guān)的不良預(yù)后因素。IGHV譜發(fā)生突變（95.7%），使用VH3-7重排。在HCL中，未突變（UM）IGHV譜和使用VH4-34通常與CDA耐藥性以及較短的無進(jìn)展生存期和總生存期有關(guān)。我們報告的第二例HCL患者同時攜帶BRAF V600E和W604L突變。該患者接受CDA加利妥昔單抗治療，達(dá)到CR。

同義突變在HCL中的作用仍有待研究。在一項對主要來自實體瘤樣本（包括黑色素瘤）的659194個同義（沉默）突變的研究中，沉默突變是僅次于錯義突變（64.1%）的第二常見的點突變類型（23.4%）。同義突變不會改變氨基酸序列，大多數(shù)在功能上是中性的。同義突變的臨床意義仍有待確定，但其可以通過改變剪接調(diào)控位點、mRNA 穩(wěn)定性、miRNA結(jié)合位點或翻譯效率來改變蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)構(gòu)象。無論是在編碼區(qū)內(nèi)還是在編碼區(qū)外，都可能影響基因表達(dá)，并可能有助于腫瘤發(fā)生和癌細(xì)胞適應(yīng)性。值得注意的是，在我們的隊列中，所有同義突變都與BRAF V600E突變共存。使用ddPCR時，由于雜交受損和檢測的特異性（無法檢測BRAF非V600突變），其他BRAF突變可能會被誤檢。這些突變在HCL發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待闡明。