基于pHLA的免疫治療平臺直接調(diào)節(jié)抗原特異性T細胞

抗原特異性(AgS)T細胞的靶向藥物激活可能繞過當(dāng)前基于T細胞的癌癥治療固有的限制。這里兩個免疫治療平臺，用于選擇性地將共刺激配體和多肽-HLA(pHLA)輸送到AgS T細胞。在這些平臺上設(shè)計和部署了一種親和力減弱的IL-2變體，它在體外選擇性地擴增寡克隆和多功能的AgS T細胞，并與CD80信號協(xié)同作用，實現(xiàn)優(yōu)于多肽刺激的增殖。

過繼T細胞療法(ACT)已顯示出令人印象深刻的臨床結(jié)果，使用患者來源的T細胞體外激活與有效的T細胞受體(TCR)。然而，由于復(fù)雜的制造和回輸要求、患者調(diào)理方案和安全考慮，細胞療法接觸到的患者較少。相比之下，系統(tǒng)共刺激代表了癌癥免疫治療的一種可擴展的藥理學(xué)方法，其目的是在患者體內(nèi)直接激活和擴大腫瘤特異性T細胞。然而，試圖用抗CD137抗體和大劑量IL-2等藥物通過全身激動劑誘導(dǎo)抗腫瘤T細胞反應(yīng)的嘗試與的毒性風(fēng)險相關(guān)。IL-2細胞因子，能夠誘導(dǎo)CD8效應(yīng)T細胞(Teff)以及其他具有抗腫瘤潛力的T、B和NK細胞系的增殖和分化。在轉(zhuǎn)移性腎細胞癌和惡性黑色素瘤的情況下，大劑量的IL-2可以在少數(shù)患者中誘導(dǎo)緩解，與AgS Teff水平升高相關(guān)，但劑量受到嚴重和潛在威脅生命的毒性的限制，如血管泄漏綜合征和細胞因子釋放綜合征。IL-2的抗腫瘤作用還受到調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的間接限制，由于高水平表達高親和力的IL-2受體，Treg在體內(nèi)有效地擴增為IL-2。Treg計數(shù)升高，可以限制Teff反應(yīng)，與癌癥患者預(yù)后不良有關(guān)。此外，針對不同的共刺激途徑的癌癥免疫治療組合具有極大地放大T細胞反應(yīng)的潛力。然而，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療中，CTLA-4和PD-1通路的聯(lián)合抑制表明，毒性也可能是復(fù)合的，限制了它們的實用性。IL-2和其他共刺激劑在癌癥中的更廣泛治療應(yīng)用可能需要將它們的作用集中在那些能夠提供大治療效果的T細胞上，特別是癌癥AgS T細胞。

癌癥疫苗代表了癌癥免疫治療的另一種可擴展的藥理學(xué)方法。然而，疫苗的效力取決于抗原提呈細胞(APC)的功能，包括運輸、抗原處理、共刺激與共抑制以及對腫瘤免疫抑制的敏感性。例如，DC是一種APC，通過遞送pHLA和強大的共刺激配體如CD80、CD86和CD137L，在啟動和維持抗腫瘤CD8 T細胞應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，DC也富含抑制配體，如TIM-3、PD-L1、PD-L2、HVEM、B7-H3、B7-H4、IL-T3和IL-4，它們削弱了T細胞的反應(yīng)，并受到局部和遠端腫瘤的影響。因此，需要安全、可擴展和APC非依賴的免疫療法，以使抗腫瘤T細胞激活和相關(guān)的腫瘤細胞殺傷達到臨床有效水平。基于控制T細胞功能的天然信號，已經(jīng)確定了這一挑戰(zhàn)的潛在解決方案：pHLA和共刺激配體，體現(xiàn)在Immuno-STAT (T細胞的選擇性靶向和改變)和Neo-STAT免疫治療平臺中。Immuno-STAT和Neo-STAT利用緊湊的、基于Fc的架構(gòu)，適合臨床制造，旨在將針對強大的共刺激劑(如IL-2)的優(yōu)化信號直接聚焦到體內(nèi)的AgS T細胞，從而增強抗腫瘤T細胞反應(yīng)，同時避免不分青紅皂白的免疫激活。

Immuno-STAT框架包括多肽表位、MHC I類等位基因、共調(diào)節(jié)劑和Fc的共價融合，賦予親和力和對稱的多價性，足以激活同源T細胞。潛在的共調(diào)節(jié)劑、共刺激和共抑制配體可以融合到MHC-Fc重鏈的N-或C-端或β2m的C-端，從而允許組織、組成和化學(xué)計量的靈活性。對Immuno-STAT平臺的初步探索利用IL-2作為共調(diào)節(jié)劑來激活和擴增AgS細胞毒效應(yīng)T細胞(Teff)。

為了確定優(yōu)化的基于IL-2的Immuno-STAT框架，評估了一組構(gòu)建體的相對效力、AgS選擇性和可制造性。構(gòu)建體由LCMV gp33-41/H-2Db組成，由小鼠TCR P14識別，在其N端與人IL-2的變體融合，并在C端與效應(yīng)減弱的小鼠IgG2a Fc融合。包括IL-2減弱突變，以限制IL-2Rα依賴的毒性和Treg結(jié)合，以及降低IL-2親和力，有利于pMHC選擇性。基于可制造性IL-2化學(xué)計量比被限制為兩個或四個，這表明蛋白質(zhì)滴度下降超過四個拷貝的IL-2。人IL-2在人和小鼠細胞上都顯示出很強的活性，包括IL-2R近端信號分子STAT5的磷酸化，以及磷酸化的STAT5(pSTAT5)作為IL-2R參與的一個指標(biāo)，它與IL-2R激動劑的下游后果（如增殖和表型標(biāo)志物的表達）有很好的相關(guān)性。比較了pSTAT5對來自AgS P14 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠和非AgS C57BL/6小鼠的純化CD8脾細胞的誘導(dǎo)作用，并根據(jù)logEC50-P14(效力指數(shù))、P14減去EC50-P14上的C57BL/6信號(選擇性指數(shù))和蛋白質(zhì)表達滴度對構(gòu)建的結(jié)構(gòu)進行了排序。構(gòu)建的LCMV-IST-IL2.FH4高，其次是LCMV-IST-IL2.F4。在這個初始篩選中，對排名靠前的候選LCMV-IST-IL2.FH4和LCMV-IST-IL2.F4的劑量反應(yīng)進行了重新評估，得到了更寬的濃度范圍和更高的分辨率。P14脾細胞pSTAT5-EC50的對數(shù)(LogEC50-P14)表明，LCMV-IST-IL2.FH4、LCMV-IST-IL2.F4、LCMV-IST-IL2.2和LCMV-IST-IL2.4之間的AgS效力沒有差異。同樣，非AgS效力(LogEC50-B6)對于這些結(jié)構(gòu)也是相似的。AgS的選擇性首先通過AGS(P14)脾細胞EC50-P14處的標(biāo)準(zhǔn)化pSTAT5信號(即50%)相對于非AgS(C57BL/6)脾細胞的差異以及AgS與非AgS脾細胞的logEC50的差異來衡量。兩種AgS選擇性的測量在構(gòu)建LCMV-IST-IL2.FH4、LCMV-IST-IL2.F4、LCMV-IST-IL2.2和LCMV-IST-IL2.4之間沒有差異。因此，相對于攜帶兩個或四個野生型IL-2拷貝的參考構(gòu)建體(LCMV-IST-IL2.2或LCMV-IST-IL2.4)，沒有觀察到F42A和H16A介導(dǎo)的IL-2R信號效力或選擇性的降低，推測部分地被增加的IL-2化學(xué)計量比所掩蓋。

接下來，測試了攜帶IL2.FH4、效應(yīng)減毒的人IgG1、HLA-A*0201和模型表位CMV pp65(495-503)或MART1(26-35)的人源化Immuno-STAT信息。對于多個供體，測定了人PBMC與特定的IST-IL2.FH4孵育10天后雙四聚體陽性的AgS CD8 T細胞的頻率。CMV-IST-IL2.FH4，而不是CMV-IST(無IL-2融合)能夠從PBMC擴增CMV特異性CD8T細胞，表明其增殖依賴于IL2.FH4的存在。同樣，CMV-IST在存在但并非不存在重組人IL-2(野生型)擴增的CMV特異性CD8 T細胞的情況下，進一步支持了IL-2R激動劑對免疫調(diào)節(jié)活性的要求。CMV-IST-IL2.FH4或MART-IST-IL2.FH4對PBMC CD8T細胞的高峰擴增(＞30倍)相似。此外，在相似的Immuno-STAT濃度下，PBMC CD8 T細胞對CMV-IST-IL2.FH4或MART-IST-IL2.FH4的反應(yīng)達到了高峰擴增。然而，在擴大培養(yǎng)和培養(yǎng)基中，CMV特異性頻率比MART特異性高。細胞因子IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和膜蛋白CD107a是表型標(biāo)記物，它們在多種情況下由淋巴細胞聯(lián)合表達與細胞毒功能有關(guān)，包括臨床上有效的抗腫瘤反應(yīng)。Immuno-STAT和肽擴增的AgS CD8 T細胞中有很大一部分表達IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和CD107a，以響應(yīng)同源肽的攻擊。對于IFN-γ、TNF-α和CD107a，對無關(guān)多肽的反應(yīng)可以忽略不計。在測量的所有濃度下，顆粒酶B對無關(guān)多肽的反應(yīng)高于零，但一般低于對同源多肽的反應(yīng)。重要的是，Immuno-STAT擴增的AgS CD8 T細胞同時表達多個這些表型標(biāo)記，類似于肽擴增的AgS CD8 T細胞，與強大的Teff群體的分化一致。表達IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和CD107a的Immuno-STAT和多肽擴增的AgS CD8 T細胞的劑量反應(yīng)也相似。與穩(wěn)健的Teff譜系一致，從多肽或Immuno-STAT擴增中分離的單細胞四聚體顯示了類似的TCRαβ寡克隆頻率分布，并且在IST和多肽擴增的CMV-的亞群之間觀察到了序列一致性，但沒有觀察到MART反應(yīng)克隆，這主要是低克隆。

模塊化Immuno-STAT框架與多種共調(diào)節(jié)劑、多肽和HLA等位基因兼容。例如，IL-2、CD80、CD86和CD137L是CD8 T細胞的有效共刺激配體，其變體可以整合到Immuno-STAT框架中。此外，除了HLA-A*0201相關(guān)多肽，AFP(403-411)/HLA-A*1101和HBVp109-118/HLA-A*2402分別具有良好的特性，癌癥和傳染病抗原在沒有共調(diào)節(jié)器的Immuno-STAT框架上表達良好(即，僅pHLA)。在這里，Immuno-STAT pHLA的表達可以很好地預(yù)測Immuno-STAT組合的表達，例如Immuno-STAT-IL2.FH4。然而，與HLA結(jié)合較弱的表位通常更難表達，包括具有臨床意義的癌癥表位，如KRAS G12D。因此，開發(fā)了Neo-STAT，它使用肽的特定位點化學(xué)結(jié)合到穩(wěn)定工程的“空”HLA，從而能夠呈現(xiàn)低親和力的肽和不能通過基因融合獲得的部分。CMV pp65(495-503)和MART1(26-35)是先前在Immuno-STAT框架上探索的模型表位，它們成功地連接到帶有IL2.FH4的Neo-STAT框架上的空HLA-A*0201(即NST-IL2.FH4)。CMV-NST-IL2.FH4選擇性擴增CMV特異性T細胞，效力與CMV-IST-IL2.FH4相似。接下來，作為對共調(diào)節(jié)器靈活性和組合共調(diào)潛力的初步探索，評估了攜帶CD80胞外區(qū)的CMV-IST(CMV-IST-CD80-2)在體外誘導(dǎo)抗原特異性增殖的能力，無論是作為單一藥物還是與CMV-IST-IL2.FH4聯(lián)合使用。雖然CMV-IST-CD80-2單獨使用不能誘導(dǎo)AgS高于本底水平的增殖，但CMV-IST-CD80-2與CMV-IST-IL2.FH4在體外擴增CMV特異性T細胞方面顯示出協(xié)同作用，并且其水平優(yōu)于肽刺激。