細(xì)胞-細(xì)胞相互作用檢測(cè)策略

在多細(xì)胞個(gè)體中，組織形成，神經(jīng)傳遞以及免疫響應(yīng)等細(xì)胞間結(jié)合的生理過(guò)程中涉及細(xì)胞-細(xì)胞相互作用（CCIs, cell-cell interactions）。CCIs產(chǎn)生或傳遞的生理信號(hào)可通過(guò)膜表面蛋白以接觸另一細(xì)胞表明受體的方式或者通過(guò)分泌化學(xué)信號(hào)的方式進(jìn)行。在細(xì)胞間信號(hào)傳遞時(shí)，CCIs發(fā)生的過(guò)程高度動(dòng)態(tài)、參與的組分也十分復(fù)雜。因此，解開(kāi)CCIs中組成成員間千絲萬(wàn)縷的關(guān)系，闡明其相關(guān)的信號(hào)通路，可幫助人們理解CCIs對(duì)人體健康與疾病的重要性，并促進(jìn)臨床開(kāi)發(fā)與細(xì)胞間通信相關(guān)的免疫療法。

目前，研究CCIs的方向主要有細(xì)胞成像，鄰近驅(qū)動(dòng)化學(xué)標(biāo)記，單細(xì)胞測(cè)序以及功能開(kāi)發(fā)等。本篇綜述文獻(xiàn)主要圍繞顯微鏡成像與化學(xué)標(biāo)記兩種研究CCIs方法進(jìn)行介紹，這些技術(shù)主要回答以下問(wèn)題：

① CCIs在何處發(fā)生？

② 發(fā)生CCIs的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是什么？

③ 哪些細(xì)胞會(huì)直接進(jìn)行接觸式相互作用？在作用過(guò)程中有什么生物分子參與？

01細(xì)胞-細(xì)胞相互作用顯微鏡成像策略

隨著顯微鏡技術(shù)與細(xì)胞表面檢測(cè)方法的發(fā)展，CCIs界面相互作用的動(dòng)態(tài)可視化成為可能。本章節(jié)內(nèi)容將重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)熒光報(bào)告基團(tuán)在CCIs研究中細(xì)胞成像的應(yīng)用研究（圖1）。

1.黏附于玻璃板上的平面脂質(zhì)雙分子層（SLBs）

在SLBs加入熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)后，借助顯微鏡技術(shù)針對(duì)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行成像，研究CCIs界面的配體-受體相互作用動(dòng)力學(xué)。該技術(shù)已被成功應(yīng)用于免疫突觸動(dòng)力學(xué)，研究T細(xì)胞表面的超分子激活簇（SMACs，supramolecular activation clusters）。

2.正交多色成像探針

利用具備高熒光檢測(cè)信號(hào)、標(biāo)記選擇性的熒光染料-蛋白偶聯(lián)物（例如，熒光標(biāo)記的鏈霉親和素mSA或者熒光標(biāo)記的納米抗體）作為成像探針，可幫助提高細(xì)胞界面的成像分辨率。這類探針有助于細(xì)胞界面結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究中的正交靶向與多色成像。

3.蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)

在相互作用的細(xì)胞表面上分別表達(dá)蛋白質(zhì)片段來(lái)探索細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。例如跨突觸的GFP蛋白片段重組（GRASP）方法中，利用兩個(gè)非熒光狀態(tài)的GFP蛋白片段檢測(cè)CCIs的相互作用時(shí)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生緊密接觸時(shí)，兩個(gè)蛋白質(zhì)片段重組后由非熒光切換為熒光狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間相互作用成像。該方法已被用于研究小鼠海馬神經(jīng)元中突觸間的相互作用。

02 細(xì)胞-細(xì)胞相互作用化學(xué)標(biāo)記策略 在CCIs界面實(shí)現(xiàn)標(biāo)記探針的激活可以了解到哪些細(xì)胞發(fā)生相互作用以及細(xì)胞界面上出現(xiàn)哪些蛋白質(zhì)與其他生物分子。化學(xué)標(biāo)記策略通過(guò)激活在細(xì)胞表面附著酶或者小分子催化劑的方式定位標(biāo)記膜表面鄰近的生物分子，利用生物素-鏈霉親和素富集后再利用質(zhì)譜、凝膠成像以及流式細(xì)胞儀等方式進(jìn)行檢測(cè)分析。 化學(xué)標(biāo)記策略可依據(jù)誘餌細(xì)胞與獵物細(xì)胞的誘導(dǎo)標(biāo)記是否需要物理相互作用分為接觸依賴標(biāo)記與無(wú)需接觸標(biāo)記兩種技術(shù)，接下來(lái)將繼續(xù)討論這兩種策略：

1.細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的接觸依賴標(biāo)記

接觸依賴標(biāo)記方法通常需要細(xì)胞表面的酶與鄰近細(xì)胞膜表面的底物發(fā)生直接接觸，隨后通過(guò)酶催化激活生物素探針標(biāo)記鄰近細(xì)胞膜表面的受體底物上。這種標(biāo)記方式基于酶與受體底物的物理接觸，可保證較小范圍的標(biāo)記半徑。

分選標(biāo)記細(xì)胞間接觸實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞相互作用標(biāo)記（LIPSTIC）與酶催化的鄰近細(xì)胞標(biāo)記（EXCELL）LIPSTIC策略的原理來(lái)自金黃色葡萄球菌的分選酶SortaseA（SrtA）能催化分選肽（LPETG）與寡聚甘氨酸（G5）受體肽產(chǎn)生共價(jià)連接。該方法通過(guò)在已知相互作用的細(xì)胞膜表面分別表達(dá)SrtA與寡聚甘氨酸（G5）受體肽，通過(guò)被激活后SrtA將分選肽上的生物素標(biāo)簽轉(zhuǎn)移至受體肽上，實(shí)現(xiàn)CCIs的捕捉。該研究成功已應(yīng)用于檢測(cè)小鼠樹(shù)突細(xì)胞與T細(xì)胞的CD40-CD40L相互作用。 后續(xù)，北京大學(xué)陳鵬課題組通過(guò)定向進(jìn)化得到了mgSrtA,該工程酶可識(shí)別待標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白上的單甘氨酸并實(shí)現(xiàn)與分選肽的共價(jià)標(biāo)記，由此提出能夠針對(duì)任意未知CCIs界面進(jìn)行標(biāo)記的酶催化的鄰近細(xì)胞標(biāo)記（EXCELL）策略，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞相互作用的原位標(biāo)記與捕獲。

2.細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的無(wú)需接觸標(biāo)記

無(wú)需接觸標(biāo)記方法通常利用酶催化或者小分子催化劑在誘餌細(xì)胞膜表面產(chǎn)生高反應(yīng)活性標(biāo)簽分子，這類標(biāo)簽分子可隨機(jī)擴(kuò)散至細(xì)胞周圍環(huán)境中，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)CCIs界面鄰近的獵物細(xì)胞標(biāo)記，其標(biāo)記效果由活性中間體的半衰期、分子濃度、標(biāo)記時(shí)間以及細(xì)胞微環(huán)境相關(guān)。

這類方法實(shí)例主要有：①APEX策略：過(guò)氧化物酶在過(guò)氧化氫的存在下，利用生物素苯酚生成活性標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)在神經(jīng)元突觸之間的蛋白-蛋白相互作用（PPIs）標(biāo)記（圖7b）；②BioID策略：生物素連接酶催化生物素Biotin與ATP，形成Biotin-AMP生物素實(shí)現(xiàn)CCIs界面相互作用蛋白質(zhì)的生物素化標(biāo)記（圖7c）；③mMap策略：利用光氧化還原催化體系，在細(xì)胞膜表面生成半衰期較短的卡賓活性中間體生物素標(biāo)簽，相比于酶促生成的活性中間體，可實(shí)現(xiàn)更好的時(shí)空分辨率。目前該策略已被實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞膜表面標(biāo)記，展示了光催化劑在化學(xué)標(biāo)記CCIs的應(yīng)用潛力。

總結(jié)

細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的發(fā)生過(guò)程高度動(dòng)態(tài)，其中暗藏的生理過(guò)程與個(gè)體健康密切相關(guān)。探索CCIs研究技術(shù)的發(fā)展將向人們?cè)诜肿铀缴辖忾_(kāi)CCIs的神秘面紗，助力細(xì)胞治療策略的開(kāi)發(fā)。本篇推送主要介紹了綜述中提及的CCIs研究技術(shù)前沿進(jìn)展，強(qiáng)烈建議對(duì)此感興趣的讀者閱讀原文獻(xiàn)學(xué)習(xí)更深入的干貨。