全外顯子基因測序在無精子癥遺傳學(xué)病因診斷中的臨床應(yīng)用研究

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的大發(fā)展，特別是基因測序技術(shù)的成熟和臨床應(yīng)用，將全外顯子基因測序（whole exome sequencing，WES）技術(shù)應(yīng)用于無精子癥的遺傳學(xué)病因診斷，拓寬了基因突變在該病發(fā)病機制中的重要作用和認(rèn)知范圍，不僅給無精子癥潛在的病理生理學(xué)研究帶來曙光，而且也為臨床上更有效的和診斷與治療提供了技術(shù)支撐。

一、無精子癥的患病情況、病因及其診斷方法

大約7%的男性受到不育癥的影響，通過精液檢測能夠確定精液異常類型并初步對不育癥進(jìn)行診斷學(xué)分類。有文獻(xiàn)認(rèn)為無精子癥占不育癥患者的19%～30%，這些患者病因明確的少于半數(shù)，其中基因或者遺傳性疾病、Y染色體特定異常是主要因素，因此需要積極尋找不育癥的病因[1]。不育癥男方因素中20%～25%為已知的基因因素，約有521個基因與男性不育癥的單基因病因存在相關(guān)性[2]。

無精子癥是指精液中無精子，至少要進(jìn)行3次以上嚴(yán)格的精液采集和檢查，且所有顯微鏡檢查未見精子的精液標(biāo)本都應(yīng)離心確定沉渣中無精子。

無精子癥的病因復(fù)雜，概括分為兩大類，一是睪丸本身生精功能障礙，稱為原發(fā)性無精子癥或非梗阻性無精子癥（nonobstructive azoospermia，NOA）；另一種是睪丸生精功能正常，但由于輸精管道阻塞或先天性輸精管缺如而導(dǎo)致產(chǎn)生的精子不能排出體外，稱為梗阻性無精子癥（obstructive azoospermia，OA）。

無精子癥的診斷需要基于病史、體格檢查、精漿生化、生殖激素、染色體及基因檢查、影像學(xué)檢查和睪丸組織活檢等綜合判斷與分析，雖然上述常規(guī)方法能夠初步鑒別NOA和OA，然而，由于多數(shù)無精子癥的病因不能明確，從而不能確立的治療方案。40%的不育癥患者的病因仍然不明確（可稱為特發(fā)性病例），需要運用新的檢測和診斷方法尋找病因，其中全外顯子基因測序（whole exome sequencing，WES）方法或許可以揭示一部分潛在的遺傳學(xué)病因。

二、全外顯子基因測序在無精子癥遺傳學(xué)病因診斷中的應(yīng)用

WES屬于第二代測序，通過外顯子DNA序列芯片或探針，將基因組中外顯子區(qū)域的DNA序列捕獲后集中進(jìn)行高通量測序，主要步驟包括：

（1）目標(biāo)區(qū)域序列的富集；（2）DNA測序；（3）生物信息學(xué)統(tǒng)計、篩選出候選基因、Sanger法驗證，找到致病基因。

雖然WES捕獲探針僅能覆蓋人類基因組的1%～1.5%，卻涵蓋了與基因功能相關(guān)的絕大多數(shù)功能性變異，即使只對編碼區(qū)域進(jìn)行高通量測序，依然能解釋至少85%的致病基因多態(tài)性或者變異，WES被認(rèn)為是一種性價比高的高通量技術(shù)。

在過去的數(shù)年中，WES技術(shù)得到不斷改進(jìn)，現(xiàn)在正迅速進(jìn)入臨床實驗室，已有許多常染色體隱性遺傳疾病的致病基因被找到，從而改變了臨床檢測和診斷的格局[3,4]。

過去的20年，應(yīng)用于診斷男性不育癥的常規(guī)遺傳學(xué)分析方法沒有變化，無精子癥的傳統(tǒng)遺傳因素檢測方法包括染色體核型分析、Y染色體微缺失、CFTR基因突變等檢測，但是僅能解釋20%的遺傳學(xué)原因，尋找潛在的遺傳學(xué)病因從而促進(jìn)臨床工作顯得尤為迫切。重度少精子癥（＜5×10^6/ml）和無精子癥等的精子計數(shù)異常是染色體核型和Y染色體微缺失檢測的指征，而候選基因的突變篩查指征為特殊的精液或者睪丸表型。采用WES技術(shù)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致不育癥的突變基因是研究熱點之一，本文將概括的綜述WES在無精子癥診斷和疾病研究領(lǐng)域?qū)ふ疫z傳學(xué)病因的新進(jìn)展和新發(fā)現(xiàn)。

三、WES在NOA遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用

NOA在男性中的患病率約1%～2%，在不育癥患者中患病率約10%～20%。大多數(shù)NOA患者的病因是未知的，既往僅有幾個基因突變被確認(rèn)為其病因?，F(xiàn)將近年來新報道的基因突變綜述如下。

1. NOA與減數(shù)分裂過程有關(guān)的新發(fā)基因突變：

在臨床上25%的無精子癥患者可觀測到減數(shù)分裂期阻滯，但是發(fā)生所有的精曲小管中純粹同質(zhì)性阻滯（或許由于單一基因的突變所致）的較少，由于大量的基因作用于減數(shù)分裂過程，因而產(chǎn)生廣泛的遺傳異質(zhì)性。Gershoni等[5,6]利用WES或全基因組測序法（whole genome sequencing，WGS）鑒定出MEIOB、X連鎖外顯子睪丸表達(dá)基因14（Testis-expressed gene 14，TEX14）和DNAH6等3個無精子癥突變，分別與減數(shù)分裂交換、子代細(xì)胞脫落、可能的快速前期運動等不同減數(shù)分裂過程相關(guān)。MEIOB基因編碼減數(shù)分裂過程中DNA雙鏈斷裂修復(fù)所需的單鏈DNA結(jié)合蛋白，其特異的在人類和小鼠睪丸表達(dá)，MeioB敲除小鼠由于減數(shù)分裂阻滯而出現(xiàn)無精子癥。

該作者新發(fā)現(xiàn)MEIOB基因純合移碼突變，其導(dǎo)致MEIOB蛋白截短，進(jìn)而保守的C端DNA結(jié)合域缺乏。另有報道[7] 2例血親家庭NOA和減數(shù)分裂阻滯的兄弟患有編碼減數(shù)分裂雙鏈斷裂形成蛋白1基因（meiotic double-stranded break formation protein 1）的純合錯義突變（MEI1；c.C3307T:p.R1103W），另1例弟弟為雜合突變；已有MEI1敲除與減數(shù)分裂阻滯相關(guān)的小鼠動物模型，這表明該突變是有害的。

多數(shù)真核生物的減數(shù)分裂同源重組由2種重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)，即參與有絲分裂和減數(shù)分裂的RAD51及減數(shù)分裂特異的DMC1；RAD51對于人類減數(shù)分裂的作用尚不清楚；小鼠敲除Rad51或者任何旁系同源Rad51，均呈現(xiàn)胚胎致死性。

Yang等[8]使用純合性基因定位和WES檢測1個患有減數(shù)分裂阻滯、無精子癥的血親家庭，發(fā)現(xiàn)1個旁系同源RAD51基因的1bp純合置換異常（c.41T＞C/p.Leu14Pro），命名為XRCC2。

通過CRISPR/Cas9方法制作的攜帶Xrcc2-c.T41C/p.Leu14Pro突變的基因敲入小鼠，純合性突變可以存活，呈現(xiàn)減數(shù)分裂阻滯、無精子癥、卵巢早衰（primary ovarian failure，POF）和不育癥。

基質(zhì)抗原3基因（stromal antigen 3，STAG3）編碼的減數(shù)分裂特異蛋白對減數(shù)分裂黏連蛋白復(fù)合物的功能性至關(guān)重要，已知STAG3序列變異導(dǎo)致雄性和雌性小鼠的減數(shù)分裂阻滯、人類POF，但是對于男性不育癥患者的意義尚不清楚。van der Bijl等[9]報道，2個導(dǎo)致完全減數(shù)分裂阻滯和不育癥的STAG3基因復(fù)合雜合變異c.[1262T＞G]；[1312C＞T]和p. [（Leu421Arg）]；[（Arg438Ter）]；Stag3基因敲除小鼠的生殖細(xì)胞發(fā)育不超過偶線期，顯示極端的染色體畸變；這表明STAG3變異負(fù)面影響蛋白功能是NOA一個少見的原因（＜1%）。

SYCE1基因編碼聯(lián)會復(fù)合體中心成分1（synaptonemal complex central element 1，SYCE1）蛋白作用于減數(shù)分裂期間聯(lián)會復(fù)合體的形成，Syce1缺失雄性和雌性小鼠罹患不育，人類SYCE1突變引起POF和NOA。Pashaei等[10]新發(fā)現(xiàn)SYCE1基因的剪接位點突變c.375-2A＞G，突變影響該基因內(nèi)含子6中的受體剪接位點，導(dǎo)致無精子癥和不育癥。

2. 無精子癥有關(guān)的X-連鎖基因的新發(fā)突變：

TEX11是減數(shù)分裂重組和染色體聯(lián)會所必需的基因，缺乏將導(dǎo)致減數(shù)分裂阻滯、無精子癥和不育癥。

Sha等[11]在2例無精子癥兄弟新發(fā)現(xiàn)TEX11突變（2653G → T, in exon 29 GenBank accession number，NM_031276），為同一外顯子的錯義突變（W856C），但其母親沒有攜帶；患者的睪丸活檢組織學(xué)揭示減數(shù)分裂阻滯，在精曲小管中沒有減數(shù)分裂后的圓形精細(xì)胞和成熟精子，TEX11在精原細(xì)胞強表達(dá)和精母細(xì)胞弱表達(dá)，但是在支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞沒有表達(dá)。

Okutman等[12]檢測2例無精子癥患者，發(fā)現(xiàn)X連鎖黑色素瘤抗原家族B4（melanoma antigen family B4，MAGEB4）基因突變，為單堿基替換（c.1041A＞T）和非終止突變，導(dǎo)致C-羥基端增加24個氨基酸；功能試驗沒有發(fā)現(xiàn)影響mRNA穩(wěn)定性、蛋白細(xì)胞內(nèi)定位以及與其他MAGE蛋白的同型或異型二聚體化，增加的氨基酸影響特有蛋白與MAGEB4配偶體之間的互相作用。

3. 在睪丸特異表達(dá)的新發(fā)基因突變：

Fakhro等[13]報道5個在NOA患者睪丸特異表達(dá)的、有害的、與疾病分離的隱性變異（CCDC155、NANOS2、SPO11、TEX14和WNK3），小鼠功能研究證明這些基因在精子發(fā)生中發(fā)揮作用。

在75例NOA患者中，有5.3%攜帶這些新發(fā)現(xiàn)的基因隱性變異，8.0%攜帶既往報道的NOA基因有害變異，13.3%患者存在遺傳學(xué)病因，而可生育的對照組則為0；說明WES可以發(fā)現(xiàn)NOA患者的一部分遺傳學(xué)病因（家族性＞50%，散發(fā)性＞10%）。

Araujo等[14]在6例NOA患者鑒定出7個基因的潛在致病變異，鑒定出2個已知與無精子癥相關(guān)的DMRT1基因變異c.671A＞G（p.（Asn224Ser））和 REC8基因變異c.91C＞T（p.（Arg31Cys）），發(fā)現(xiàn)的新變異包括已知中等證據(jù)、與精子發(fā)生障礙有關(guān)的TEX15和KLHL10，有限證據(jù)的DNMT3B和TEX14，迄今為止沒有證據(jù)、有希望成為候選基因的SYCE1L。

4. 在睪丸和卵巢均可發(fā)揮作用的新發(fā)基因突變：

He等[15]發(fā)現(xiàn)DMC1基因的純合錯義突變（NM_007068.3:c.106G＞A，p.Asp36Asn）為1個家族NOA和POF患者表型的共同異常，導(dǎo)致DMC1基因修改的H3TH基序中保守的天冬氨酸殘基與天冬酰胺發(fā)生置換，從而引起蛋白錯誤折疊。

研究證實患者精曲小管內(nèi)缺乏精子，精子發(fā)生阻滯于減數(shù)分裂前期Ⅰ期的偶線期。

Jaillard等[16]報道1例POF