腦小血管病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、制備方法及中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制研究
文章來源：賢集網(wǎng)發(fā)布日期：2022-09-21瀏覽次數(shù)：118 腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）是由各種病因影響腦內(nèi)小動(dòng)脈、微動(dòng)脈、毛細(xì)血管、小靜脈和微靜脈所導(dǎo)致的一系列臨床、影像、病理綜合征[1]。CSVD占所有缺血性卒中的25%，也是血管性癡呆的主要原因。與正常人相比，CSVD患卒中的風(fēng)險(xiǎn)會增加1倍，發(fā)展成血管性癡呆的風(fēng)險(xiǎn)會增加3倍[2]。該病臨床表現(xiàn)不一，急性CSVD可表現(xiàn)為腔隙綜合征，慢性CSVD隱匿起病，可無臨床癥狀，隨著病變進(jìn)展患者可出現(xiàn)認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)、情感和二便障礙等表現(xiàn)。CSVD臨床診斷5851主要依靠影像學(xué)檢查，尚缺乏規(guī)范診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也無特異性治療藥物[1]。近年來中醫(yī)藥在CSVD的干預(yù)治療中提供了新的切入點(diǎn)并展現(xiàn)出良好的成效[3]，目前對CSVD的病因病機(jī)雖無統(tǒng)一認(rèn)識，但多數(shù)現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為CSVD病位在腦和絡(luò)脈，與肝、脾、腎及督脈密切相關(guān)，病性屬虛實(shí)夾雜之證，以肝、脾、腎等臟腑虧損，精血虧虛為本，痰濁、瘀血為標(biāo)，病機(jī)為臟腑功能失調(diào)及夾痰、夾瘀血上擾腦竅[4]，采用補(bǔ)腎填精固本、健脾益氣化痰、活血化瘀通絡(luò)等法進(jìn)行辨證論治均收到良好效果[5]。為進(jìn)一步探索CSVD的中西醫(yī)病理機(jī)制和防治，復(fù)制具有CSVD病理特點(diǎn)和臨床表現(xiàn)的動(dòng)物模型是關(guān)鍵。目前研究人員構(gòu)建CSVD模型的方法有阻塞頸動(dòng)脈致腦低灌注損傷、模擬慢性高血壓腦損傷、基因修飾、微小栓子栓塞等，模型病理觀察可見小血管病變、腔隙性腦梗死和腦白質(zhì)病變3種主要病變[6]。本文綜述了4種CSVD病理模型的建立、動(dòng)物行為學(xué)與組織病理改變、模型優(yōu)缺點(diǎn)等，以期為研究CSVD的中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制和藥物防治提供建模參考。1、低灌注損傷CSVD模型1.1雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞（bilateral carotid artery occlusion，BCAO）或狹窄模型BCAO模型是采用外科縫線結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈而建立的[7]。造模后即刻皮質(zhì)腦血流量下降超過70%[8]，2～3個(gè)月逐漸恢復(fù)至基線的50%～90%[7,9]。術(shù)后4～5周會出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力受損相關(guān)的認(rèn)知障礙[10]。術(shù)后3～7 d，病理觀察可見視神經(jīng)和視束、側(cè)腦室、胼胝體、內(nèi)囊和尾殼纖維束出現(xiàn)白質(zhì)病變，尤以視神經(jīng)和視束為明顯[11]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）模型是將內(nèi)徑0.18 mm、節(jié)距0.50 mm、總長度2.5 mm的微線圈纏繞在C57Bl/6小鼠一側(cè)頸總動(dòng)脈分叉附近，間隔半小時(shí)后，將另一微線圈纏繞在對側(cè)頸總動(dòng)脈對稱的位置而構(gòu)建[12]。術(shù)后2 h，腦血流量降至67%，術(shù)后1 d腦血流量開始恢復(fù)[12]。術(shù)后22 d小鼠表現(xiàn)出明顯的短期記憶缺陷[13]。術(shù)后1個(gè)月病理可見胼胝體、尾殼核、內(nèi)囊和視束發(fā)生白質(zhì)病變，且以胼胝體，同時(shí)可見小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活增殖[12]。術(shù)后6個(gè)月小鼠磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢測可見嚴(yán)重的白質(zhì)病變、腦萎縮、多發(fā)性局灶性皮質(zhì)下梗死，同時(shí)病理可見血管破裂伴有膠原堆積、管壁增大、纖維蛋白沉積和血管纖維素樣壞死[14]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈不對稱狹窄模型（asymmetrical common carotid artery stenosis，ACAS）的構(gòu)建方法是將微線圈（內(nèi)徑0.18 mm）纏繞在C57BL/6J小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，同時(shí)將Ameroid慢性縮窄環(huán)（內(nèi)徑0.5 mm、外徑3.25 mm、長度1.28 mm）植入右側(cè)頸總動(dòng)脈對稱的位置（圖2）。術(shù)后28 d植入Ameroid側(cè)頸總動(dòng)脈完全閉塞，腦血流量為73%。微線圈側(cè)腦血流量為75%。在神經(jīng)功能和行為方面，小鼠術(shù)后14 d出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)和神經(jīng)肌肉無力，28 d出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，病理改變可見右側(cè)皮質(zhì)下多處缺血性梗死灶，左側(cè)腦白質(zhì)稀疏和神經(jīng)膠質(zhì)增生[15]。綜上，3種模型均可見白質(zhì)病理改變，可作為研究CSVD白質(zhì)損傷伴有認(rèn)知障礙的模型。雖然BCAO模型操作簡單成本低，但大鼠死亡率較高且缺血損傷視神經(jīng)會對認(rèn)知功能評估造成影響[15]，不適合推廣應(yīng)用。為降低BCAO模型的死亡率，有學(xué)者在BCAO模型的基礎(chǔ)上發(fā)明了改良兩血管閉塞模型（modified 2 vessel occlusion，Modified 2VO），本模型是用外科縫線先結(jié)扎大鼠一側(cè)頸總動(dòng)脈，間隔1周后再結(jié)扎對側(cè)頸總動(dòng)脈而建立的，大鼠在行為和形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)與BCAO相似[16-17]，但死亡率下降。BCAS模型操作簡單、成本和死亡率低且?guī)缀醪粨p傷視神經(jīng)，使用內(nèi)徑為0.18 mm微線圈造模，其模型重復(fù)性較高，比較適合研究的廣泛應(yīng)用。ACAS模型術(shù)后死亡率約為20%，可造成小鼠白質(zhì)梗死伴認(rèn)知功能障礙，由于雙側(cè)頸總動(dòng)脈使用不同的造模裝置可造成2側(cè)大腦半球缺血程度的不同，因此可以作為評價(jià)某些藥物對缺血療效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。局限性在于模型制作成本高且未見微血管病變[15]。低灌注損傷CSVD模型與中醫(yī)瘀阻腦絡(luò)證型病理機(jī)制相似，瘀血阻于腦脈，氣血不通，腦髓失養(yǎng)，則出現(xiàn)神識不清、癡呆等癥狀，可用于瘀阻腦絡(luò)型CSVD的相關(guān)研究[5]。1.2立體定向藥物注射模型立體定向藥物注射模型是通過立體定向?qū)?nèi)皮素-1和一氧化氮合酶抑制劑N(G)硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）聯(lián)合注入重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠內(nèi)囊后肢造成腦血管收縮降低腦血流量建立的。造模成功后，小鼠可出現(xiàn)的神經(jīng)功能障礙，術(shù)后1 d MRI彌散加權(quán)成像顯示內(nèi)囊后肢高信號。術(shù)后8周病理可見局限性軸突和髓鞘丟失，周圍有反應(yīng)性膠質(zhì)增生，微血管收縮，微梗塞形成，此方法可復(fù)制CSVD皮質(zhì)下微梗死模型[18]。當(dāng)內(nèi)皮素-1或L-N5-(1-亞氨基乙基)鳥氨酸（L-NIO）注射到小鼠的腦室周圍白質(zhì)或皮質(zhì)下白質(zhì)時(shí)，小鼠未見神經(jīng)功能障礙，但可見局部白質(zhì)病變，此方法可復(fù)制CSVD白質(zhì)病變模型[19]。本模型建模的優(yōu)點(diǎn)在于定位準(zhǔn)確，局限性在于縮血管藥物滲漏到腦室會造成高死亡率，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)針頭與大腦矢狀面成30°針刺夾角時(shí)可明顯降低死亡率[20]。2、高血壓相關(guān)性CSVD模型2.1自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rat，SHR）模型SHR是由患有高血壓的成年Wistar大鼠培育獲得。12周齡SHR的收縮壓＞200 mm Hg（1 mm Hg＝133 Pa）。30～34周齡SHR出現(xiàn)非空間工作記憶受損。35周齡SHR行MRI檢查可見大腦萎縮和白質(zhì)丟失，組織學(xué)分析證實(shí)了白質(zhì)脫髓鞘和局限性血腦屏障功能障礙，并伴有皮質(zhì)深層的小膠質(zhì)細(xì)胞和大膠質(zhì)細(xì)胞活化[21]，甚至出現(xiàn)大腦皮層梗死出血，血管周圍間隙明顯增大等[22-23]。幼年SHR出現(xiàn)明顯的腦部宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的改變，表明SHR可能是一種早期CSVD的有效實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[21]。高鹽飲食喂養(yǎng)SHR能加重血管病變，HE染色可見小動(dòng)脈同心性透明增厚，管腔狹窄，血管周圍增大，與人類動(dòng)脈硬化性CSVD的血管病理結(jié)果相似，可作為模擬動(dòng)脈硬化性CSVD動(dòng)物模型[24]。Kitamura等[25]將CSVD危險(xiǎn)因素高血壓和腦低灌注損傷因素相結(jié)合構(gòu)建了自發(fā)性高血壓大鼠/雙側(cè)頸動(dòng)脈逐漸閉塞（SHRs subjected to the bilateral common carotid artery gradual occlusion，SHR-2VGO）模型，其建模方法是將Ameroid慢性縮窄環(huán)（內(nèi)徑0.5 mm）分別植入SHR雙側(cè)頸總動(dòng)脈對稱的位置。造模后7 d腦血流量緩慢下降到基線水平的68%，28 d腦血流量逐漸恢復(fù)基線水平的82%，大鼠空間工作記憶明顯損傷，白質(zhì)病變突出，病理觀察到膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和促炎因子明顯增加，但未見明顯的血腦屏障破壞，推測可能是由于小血管病理損傷較輕。SHR和SHR-2VGO模型都可作為研究CSVD白質(zhì)病變的模型，但后者更符合CSVD臨床病理演變的過程且能縮短模型實(shí)驗(yàn)周期。2.2易卒中自發(fā)性高血壓性CSVD模型易卒中自發(fā)性高血壓大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive rat，SHRSP）是在SHR基礎(chǔ)上培育出的亞系。雄性SHRSP卒中自發(fā)率高達(dá)80%，3月齡SHRSP收縮壓約為200 mm Hg。24周齡SHRSP非空間記憶能力下降，而空間學(xué)習(xí)能力受損不明顯[21]，4～5個(gè)月開始出現(xiàn)腦白質(zhì)變化，9個(gè)月時(shí)出現(xiàn)梗死和出血[26]。病理可見內(nèi)皮損傷，血腦屏障功能障礙，小動(dòng)脈壁增厚、變性和血管周圍組織改變，導(dǎo)致血管破裂和微出血。SHRSP高鹽暴露會加速高血壓和梗死的發(fā)展，高鹽攝入可能會增加血腦屏障通透性，增加活性氧的產(chǎn)生，并導(dǎo)致大鼠過早死亡[27-28]。因此將SHRSP作為CSVD動(dòng)物模型時(shí)應(yīng)該避免動(dòng)物鹽暴露[29]。此模型具有明顯的白質(zhì)疏松及小血管病變，是良好的高血壓性CSVD白質(zhì)病變模型[30]。2.3易卒中腎血管性高血壓性CSVD模型易卒中腎血管性高血壓大鼠（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP）模型是用銀夾（內(nèi)徑0.3 mm）夾閉SD大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈根部誘發(fā)高血壓構(gòu)建的。RHRSP卒中自發(fā)率約為62%。術(shù)后12周RHRSP收縮壓維持在200 mm Hg左右。20周齡RHRSP出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。6周齡RHRSP病理可見明顯局灶性腦損傷（腦梗死、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血）和神經(jīng)功能缺陷（偏癱癲癇等）。20周齡RHRSP通過MRI T2加權(quán)像檢測出了彌漫性、融合性白質(zhì)高信號，以穹窿部。病理學(xué)方面可見白質(zhì)明顯疏松且有空泡形成，白質(zhì)髓鞘和神經(jīng)纖維消失，支持神經(jīng)影像學(xué)的發(fā)現(xiàn)。同時(shí)也觀察到腦內(nèi)小動(dòng)脈纖維蛋白樣壞死、透明質(zhì)增生和血管重塑，血腦屏障破壞和血漿白蛋白漏入組織間隙的病理表現(xiàn)。此模型符合CSVD的白質(zhì)病變和小血管病理改變[31-32]。此外，有學(xué)者在構(gòu)建RHRSP的基礎(chǔ)上用5-0的絲線先結(jié)扎大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，間隔1周后再結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，建立了易卒中腎血管性高血壓大鼠/改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞復(fù)合動(dòng)物模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat/modified 2 vessel occlusion，RHRSP/Modified 2VO）。術(shù)后12周大鼠收縮壓＞180 mm Hg，大鼠存在明顯的空間認(rèn)知障礙。病理改變可見彌漫性白質(zhì)病變，明顯的脫髓鞘、空泡形成和神經(jīng)纖維消失，尤以側(cè)腦室旁的胼胝體為明顯，在胼胝體內(nèi)可見I型和IV型靜脈膠原沉積。白質(zhì)區(qū)的小血管可觀察到管壁向心性增厚、血管重塑和管腔狹窄[33]。RHRSP和RHRSP/Modified 2VO模型均可見到符合CSVD的白質(zhì)病變和小血管病理改變，可作為研究CSVD白質(zhì)病變伴認(rèn)知障礙模型，模型易于建立，成本低，缺陷在于大鼠體型差異難以控制腎動(dòng)脈狹窄程度，可能會造成腎功能損害[10]。2.4血管緊張素II誘導(dǎo)高血壓性CSVD模型血管緊張素II誘導(dǎo)高血壓性CSVD模型是在C57BL/6N小鼠皮下植入含有AngII微型泵［1000 ng/(kg·min)，輸注率為11μL/h］并在飲水中加入L-NAMEL（100 mg/kg），從而誘發(fā)高血壓建立。持續(xù)給藥4周后收縮壓可達(dá)150 mm Hg左右。模型小鼠在行為學(xué)方面表現(xiàn)出認(rèn)知功能和記憶明顯下降。MRI檢查可見腦室增大和海馬萎縮、散發(fā)性小梗死和微出血，但未見明顯的白質(zhì)損傷，彌散張量成像可見白質(zhì)密度降低，推測可能與實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的高血壓周期太短有關(guān)（4周）。病理可見腦血管壁肥厚、神經(jīng)血管單位結(jié)構(gòu)損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、血腦屏障滲漏、內(nèi)皮細(xì)胞活化和免疫細(xì)胞聚集。該模型有類似于早發(fā)CSVD的關(guān)鍵特征，包括動(dòng)脈病變、血腦屏障損傷、神經(jīng)炎癥、白質(zhì)改變的早期跡象，并具有典型的CSVD神經(jīng)心理學(xué)特征，可作為高血壓相關(guān)早發(fā)性CSVD的小鼠模型[34]。本模型的局限性在于藥量需求大，成本較高，不能模擬慢性高血壓長期損害的病理過程。2.5主動(dòng)脈縮窄高血壓性CSVD模型主動(dòng)脈縮窄高血壓性CSVD模型是通過手術(shù)將恒河猴胸主動(dòng)脈前2～4 cm的血管直徑縮小到2.0～2.5 mm從而誘發(fā)高血壓建立的（圖3）。術(shù)后1年發(fā)現(xiàn)收縮壓＞150 mm Hg的恒河猴在注意力、記憶力、執(zhí)行力等認(rèn)知和行為方面都有的損害，而收縮壓＜150 mm Hg的恒河猴認(rèn)知損害不明顯，表明認(rèn)知功能損害與血壓升高相關(guān)[35]。神經(jīng)病理學(xué)上，的病變是形狀不規(guī)則的微梗死（直徑＜500μm），伴有局灶性膠質(zhì)細(xì)胞增生，散在分布于大腦皮質(zhì)、腦干和小腦的灰質(zhì)和白質(zhì)，尤其是前腦白質(zhì)[36-38]。小動(dòng)脈病變可見血管壁增厚。此方法可復(fù)制CSVD相關(guān)的白質(zhì)微血栓伴認(rèn)知功能障礙模型。本模型的優(yōu)點(diǎn)在于使用靈長類動(dòng)物造模更能模擬人類病理狀態(tài)，局限性在于動(dòng)物倫理要求更嚴(yán)，成本更高。3、基因修飾相關(guān)CSVD模型3.1內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因缺陷小鼠模型一氧化氮是腦血管功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的鳥苷環(huán)偶聯(lián)受體，參與腦血流的自動(dòng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)元突觸前適應(yīng)性調(diào)節(jié)。eNOS是血管中一氧化氮的主要來源。有學(xué)者通過基因工程技術(shù)敲除小鼠eNOS基因構(gòu)建了eNOS基因缺陷小鼠模型。幼年小鼠出現(xiàn)腦灌注不足、氧化應(yīng)激、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和血腦屏障滲漏，滲漏以額葉和頂葉皮質(zhì)為主，隨著年齡的增長，可擴(kuò)展到大腦深部區(qū)域（如顳頂葉皮質(zhì)和海馬），還可見到CSVD相關(guān)的臨床表現(xiàn)如腦淀粉樣血管?。╟erebral amyloid angiopathy，CAA）、微出血、微梗死和白質(zhì)病變。中年小鼠可見嚴(yán)重的白質(zhì)病變、皮質(zhì)層II／III和V錐體神經(jīng)元神經(jīng)變性以及步態(tài)障礙。老年小鼠出現(xiàn)海馬依賴性記憶障礙。此模型直接將慢性低灌注和脫髓鞘與神經(jīng)變性聯(lián)系起來可作為年齡依賴性自發(fā)性CSVD模型，該模型的局限性在于微梗死的偶發(fā)性并且很難確定低灌注程度[39]。3.2 CAA模型CAA是β-淀粉樣蛋白（amyloidβprotein，Aβ）在軟腦膜和皮質(zhì)層的中小動(dòng)脈以及腦毛細(xì)血管內(nèi)沉積為主要病理特征的CSVD[40-41]。有學(xué)者將人APP770SwDI構(gòu)建物通過顯微鏡注射到SD大鼠的卵母細(xì)胞中構(gòu)建了rTg DI轉(zhuǎn)基因大鼠CAA模型，大鼠3個(gè)月時(shí)在大腦皮質(zhì)、海馬和丘腦可見早期和進(jìn)行性腦微血管Aβ蓄積，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，并伴有早期和持續(xù)性的行為障礙。12個(gè)月時(shí)大腦微血管Aβ沉積會導(dǎo)致毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生血管周圍神經(jīng)炎，還可見微出血和小血管閉塞（丘腦為主），另外還能觀察到血管周細(xì)胞變性，星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白酶-3激活，以及神經(jīng)元軸突完整性的破壞，這些結(jié)構(gòu)改變都很容易被MRI檢測到[42-43]。該模型大鼠在腦中產(chǎn)生低水平的人類家族性CAA荷蘭/愛荷華州E22Q/D23N突變的Aβ，可作為遺傳性CAA荷蘭型的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本模型選用大鼠作為建模動(dòng)物相較于小鼠更有優(yōu)勢，因?yàn)榇笫笈c人類更接近。rTg DI大鼠為研究小血管CAA和微出血的發(fā)病機(jī)制和測試干預(yù)治療措施提供了一種新的模型[42]。3.3絲氨酸蛋白酶1（high-temperature requirement A serine peptidase 1，HTRA1）基因重組小鼠模型HTRA1基因突變可導(dǎo)致單基因遺傳性CSVD即伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體隱性遺傳性腦動(dòng)脈?。╟erebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leuconcephalopathy，CARASIL）。HTRA1基因突變導(dǎo)致HTRA1酶活性下降、功能喪失[44]，使腦小血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中膜丟失變薄、內(nèi)彈力層斷裂、外膜的細(xì)胞外基質(zhì)變薄、基質(zhì)中纖維玻璃樣物質(zhì)沉積，隨后小動(dòng)脈管腔狹窄或擴(kuò)張導(dǎo)致缺血或出血性病變。Li等[45]利用成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9）基因編輯技術(shù)建立了一種表達(dá)人HTRA1基因L364P突變體的重組小鼠模型。觀察到人HTRA1基因主要在小鼠VSMCs細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，誘導(dǎo)VSMCs凋亡，導(dǎo)致VSMCs大量丟失，還可見與CARASIL患者類似的卒中、脫毛、腦動(dòng)脈向心性增厚和結(jié)構(gòu)紊亂等臨床表現(xiàn)和血管病理改變。該模型小鼠有助于闡明CARASIL的病理機(jī)制，為臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。3.4伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈?。╟erebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）基因突變小鼠模型Notch3基因錯(cuò)義突變可導(dǎo)致一種常見的遺傳性CSVD即CADASIL[46]。CADASIL病理特點(diǎn)是在中小型動(dòng)脈中聚集顆粒狀嗜鋨物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致VSMCs的進(jìn)行性退化。TgNotch3R90C、TgNotch3C428S、TgNotch3R169C、TgNotch3R1031C、TgNotch3C455R均可見NOTCH3ECD積聚和嗜鋨物質(zhì)沉積，其中R169C表型還可見白質(zhì)損傷及嚴(yán)重的認(rèn)知功能下降[47]。WT人Notch3、WT鼠Notch3、TgNotch3R142C均未見血管病理表現(xiàn)，也無白質(zhì)病變和缺血事件發(fā)生。TgNotch3R170C小鼠可出現(xiàn)嗜鋨物質(zhì)沉積、VSMCs結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞間隙擴(kuò)大、微出血、微梗死、纖維膠質(zhì)增生病理改變和共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等神經(jīng)學(xué)特征[48]。由于TgNotch3R182C小鼠表現(xiàn)出隨著年齡和NOTCH3 RNA表達(dá)水平的遞增，嗜鋨物質(zhì)不斷在血管沉積，然而并沒有腦實(shí)質(zhì)損害發(fā)生[49]，因此認(rèn)識到“Notch3評分”是CADASIL的定量生物標(biāo)記物，可以試圖將CADASIL轉(zhuǎn)基因小鼠用于臨床治療前測試模型[50]。3.5Ⅳ型膠原蛋白α1（α1 type IV collagen，COL4A1）基因突變小鼠模型COL4A1基因編碼COL4A1鏈，COL4A1是基底膜的主要結(jié)構(gòu)成分，COL4A1基因突變大部分是由膠原結(jié)構(gòu)域內(nèi)Gly-X-Y重復(fù)序列內(nèi)高度保守的甘氨酸殘基改變所致[51]，臨床表現(xiàn)為成人小血管疾病、家族性孔腦畸形、遺傳性的血管病腎病動(dòng)脈瘤和肌肉痛性痙攣綜合征[52]。Gould等[53]將COL4A1突變雄性小鼠的精子與C57BL/6J雌性小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，然后將胚胎移植到FVB/NJ雌性小鼠體內(nèi)分娩產(chǎn)生雜合子COL4A1+/Δex40小鼠。小鼠容易發(fā)生自發(fā)性多灶性腦出血，以基底節(jié)區(qū)為主，導(dǎo)致腦出血的原因可能由于突變基因?qū)е卵苌僧惓：图?xì)胞內(nèi)膠原增加相關(guān)，除此之外還與環(huán)境因素（如出生創(chuàng)傷）有一定關(guān)系。成年小鼠中可出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷，包括癲癇發(fā)作和偏癱。此外還可見到本病的其他表型如視網(wǎng)膜血管扭曲、腎小球基底膜缺陷以及微量白蛋白尿。此模型可復(fù)制COL4A1基因突變相關(guān)CSVD的腦出血模型。4、微小栓子栓塞CSVD模型4.1微球注射微梗死模型Silasi等[54]通過彈槍將2000顆小熒光微球（直徑約20μm）注射到Thy1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈，同時(shí)短暫阻斷翼腭動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，構(gòu)建了CSVD微梗死模型（圖4）。微球的直徑以接近嚙齒動(dòng)物穿透小動(dòng)脈的大小（10～20μm）為宜。微球滯留在大腦中的分布以大腦皮質(zhì)和丘腦居多，微球滯留導(dǎo)致7%的微梗死，16%的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，21%的微球引發(fā)了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。術(shù)后4周小鼠出現(xiàn)了的粗大運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知功能損害。病理可見微閉塞的海馬區(qū)細(xì)胞丟失或神經(jīng)元萎縮，白質(zhì)束內(nèi)的軸突以及紋狀體和丘腦出現(xiàn)氣泡或破壞，還可見血管損傷。此模型優(yōu)勢在于可以研究微梗死的分布區(qū)域，局限性在于操作技術(shù)要求較高[54-55]。4.2高膽固醇血癥栓塞模型由于高膽固醇血癥在微血管病理性腦缺血發(fā)展中的作用存在爭議，因此Kraft等[56]給予低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）缺失轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)脈粥樣硬化飲食（15%乳脂和1.25%膽固醇）9周可誘導(dǎo)小鼠患高膽固醇血癥進(jìn)而導(dǎo)致血栓栓塞而構(gòu)建此模型。該研究未報(bào)告模型小鼠認(rèn)知及神經(jīng)功能表現(xiàn)。在6月齡LDLR?/?小鼠中發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞凝集素明顯增高，12月齡LDLR?/?小鼠中紅細(xì)胞凝集素明顯減少，而纖維蛋白血栓增加。此模型表明了高膽固醇血癥與血栓性CSVD表型有關(guān)，LDLR?/?小鼠似乎是研究微閉塞CSVD的合適動(dòng)物模型。本模型的優(yōu)點(diǎn)在于造模方法簡便可行，缺陷在于同時(shí)也能造成大血管的動(dòng)脈粥樣硬化，增加模型的復(fù)雜性。中醫(yī)認(rèn)為年老體虛、飲食不節(jié)會損傷脾胃導(dǎo)致脾失健運(yùn)，痰濁內(nèi)生，氣機(jī)升降失調(diào)，氣血運(yùn)行受阻日久而成瘀。而本模型是通過高脂飲食誘發(fā)高膽固醇血癥損傷血管內(nèi)皮導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化而誘發(fā)的栓塞，與中醫(yī)“飲食不節(jié)，恣食肥甘”損傷脾胃導(dǎo)致的痰瘀互結(jié)證候有相類似的病機(jī)改變，可用于痰瘀互結(jié)型CSVD的生物學(xué)機(jī)制研究。5、結(jié)語CSVD是由于顱內(nèi)微小血管的動(dòng)態(tài)彌漫性病變所致的腦微血管疾病，是腦卒中和血管性癡呆的主要病因，具有高隱匿性、高發(fā)病率、高致殘率等特點(diǎn)，發(fā)病機(jī)制可能與腦血流量減少或慢性大腦低灌注、內(nèi)皮功能障礙、血-腦脊液屏障功能受損、炎癥反應(yīng)和遺傳等因素有關(guān)。為有效探尋CSVD的中西醫(yī)病理機(jī)制及防治方法，制備合適的且能展示中醫(yī)藥特色優(yōu)勢的動(dòng)物模型尤為重要。目前針對CSVD模型的動(dòng)物種屬主要是嚙齒類動(dòng)物，其中大鼠、小鼠、沙鼠應(yīng)用較多，非人靈長類動(dòng)物應(yīng)用較少，卻具有嚙齒類動(dòng)物無法比擬的優(yōu)勢，大腦與人類更相似，可以作為未來相關(guān)研究的主要?jiǎng)游镞x擇。雖然本文綜述了4種與CSVD相關(guān)的動(dòng)物模型（低灌注損傷CSVD模型、高血壓靶器官損傷CSVD模型、基因修飾CSVD模型、微小栓子栓塞CSVD模型），其特征見表1，但迄今為止尚沒有任何一種動(dòng)物模型能夠完全復(fù)制CSVD的病理特點(diǎn)，且大部分是通過單一因素造模，針對復(fù)合因素制備的模型不多，故仍需深入探索符合臨床特點(diǎn)并能模擬臨床病理演變過程的動(dòng)物模型開發(fā)?；诙嘁蛩囟喟悬c(diǎn)制備的復(fù)合型CSVD動(dòng)物模型，將有助于推動(dòng)CSVD發(fā)病機(jī)制研究，促進(jìn)防治本病的中醫(yī)藥創(chuàng)新藥物研發(fā)，凸顯中醫(yī)藥的臨床優(yōu)勢。 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