拉曼光譜解密細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰如何影響細(xì)胞活性！

冷凍保存技術(shù)是將細(xì)胞長(zhǎng)期維持在穩(wěn)定的狀態(tài)，從而應(yīng)用于各種疾病的診斷和治療。據(jù)1970年代以來(lái)的研究顯示，多種類型細(xì)胞冷凍保存后的存活率會(huì)隨著冷凍速率的不同而不同。大多數(shù)種類細(xì)胞的存活率與冷凍速率呈倒U形關(guān)系：即當(dāng)超過(guò)佳冷卻速率后，細(xì)胞存活率隨冷凍速率的增加而迅速下降，當(dāng)?shù)陀诩牙鋮s速率時(shí)，細(xì)胞存活率隨冷凍速率的降低而迅速下降。在快速冷凍速率下，細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成（Intracellular ice formation，IIF）會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，并隨著冷凍速率的增加導(dǎo)致細(xì)胞活性喪失。然而，IIF的機(jī)制仍無(wú)定論，目前業(yè)內(nèi)存在的主要有以下三個(gè)假設(shè)：（1）Mazur假設(shè)稱細(xì)胞外冰晶可以穿過(guò)膜孔生長(zhǎng)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)冰晶形成；（2）Asahina則認(rèn)為冷凍直接破壞細(xì)胞膜是導(dǎo)致IIF的原因；（3）Toner等人則提出表面催化形成晶核是造成IIF的原因。 傳統(tǒng)低溫光學(xué)顯微鏡技術(shù)是有限的，高速圖像采集和雙光子顯微鏡可以提高觀察細(xì)胞冷凍的空間和時(shí)間分辨率，雖然可以在低溫下觀察細(xì)胞反應(yīng)，卻不能與每個(gè)細(xì)胞的活性相關(guān)聯(lián)。顯微拉曼光譜技術(shù)可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)標(biāo)記檢測(cè)，并可用于細(xì)胞內(nèi)水的熱力學(xué)狀態(tài)（即液態(tài)水與冰）等化學(xué)屬性進(jìn)行識(shí)別，因此可作為探究細(xì)胞冷凍反應(yīng)的有力工具。此外，顯微拉曼光譜的高空間分辨率和可區(qū)分細(xì)胞膜、線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的能力意味著該工具可用于進(jìn)一步探究IIF及其成因，并通過(guò)拉曼光譜能夠直接表征IIF對(duì)細(xì)胞活性的影響進(jìn)而判別冷凍細(xì)胞后的活性。 研究結(jié)果表明顯微拉曼光譜技術(shù)可用于研究細(xì)胞在不同冷凍速率和冷凍液成分下的冷凍反應(yīng)。通過(guò)拉曼光譜發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰晶形成并不一定會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但細(xì)胞內(nèi)冰晶的數(shù)量及大小會(huì)影響細(xì)胞活性。另外研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)冰晶形成靠近于細(xì)胞膜并靠近于細(xì)胞外冰晶，而通過(guò)增加細(xì)胞膜和細(xì)胞外冰晶間的距離可以減少IIF；實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞松弛素D破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架以改變細(xì)胞膜的滲透性來(lái)增加胞內(nèi)冰晶形成量，當(dāng)存在胞內(nèi)冰晶時(shí)，可以的觀察到細(xì)胞內(nèi)滲透梯度，這些觀察結(jié)果揭示了細(xì)胞膜與胞外冰晶的相互作用是導(dǎo)致IIF的原因。

此項(xiàng)研究選用Jurkat細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞的模型細(xì)胞，采用的共聚焦顯微拉曼系統(tǒng)Alpha 300R配備：UHTS300光譜儀、600 l/mm光柵以及DV401 CCD檢測(cè)器。激發(fā)光源波長(zhǎng)為532 nm，100×物鏡(NA=0.9)，聚焦在被測(cè)物上的光功率為10mW，顯微分辨率約為296 nm。將細(xì)胞冷凍至-50℃，并在成像前保持20分鐘。每幅圖像有60×60個(gè)像素，每個(gè)像素點(diǎn)采集的積分時(shí)間為0.2秒，因此，對(duì)整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像總共需要12分鐘。分別在第20、80和140分鐘時(shí)對(duì)相同細(xì)胞進(jìn)行拉曼光譜成像采集，以排除來(lái)自激光照射帶來(lái)的光損傷/光漂白的熱量影響。

單細(xì)胞中細(xì)胞色素c的分布被作為冷凍狀態(tài)下細(xì)胞活性的衡量標(biāo)準(zhǔn)，其拉曼成像結(jié)果與臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果高度一致。細(xì)胞色素c的空間分布使用 Moran's I量化，并被用作細(xì)胞活性的標(biāo)記。Moran's I是一種基于信號(hào)位置和強(qiáng)度的進(jìn)行空間相關(guān)性度量的方法，其值為-1時(shí)表示信號(hào)完全分散，+1時(shí)表示信號(hào)完全相關(guān)，0時(shí)表示信號(hào)隨機(jī)分布。細(xì)胞色素c在750、1127、1314和1585 cm-1處具有強(qiáng)烈的拉曼信號(hào)，本實(shí)驗(yàn)以1127 cm-1作為標(biāo)記峰用于生成細(xì)胞色素c的拉曼成像，并通過(guò)吖啶橙/碘化丙啶（Acridine orange/Propidium iodide，AO/PI）染色驗(yàn)證解凍后細(xì)胞的活性。根據(jù)常見(jiàn)的細(xì)胞內(nèi)、外物質(zhì)的特征峰位置，整合每個(gè)像素的光譜來(lái)組合拉曼成像，表征冰晶的大小、冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞內(nèi)濃度以及外部冰與細(xì)胞膜的接近程度。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

細(xì)胞色素c的拉曼光譜可表征細(xì)胞復(fù)溫后活性

解凍后細(xì)胞復(fù)蘇率與冷凍速率的之間的函數(shù)繪制曲線呈倒U形，可知“佳”冷凍速率為1-3℃/min，當(dāng)冷凍速率高于該曲線時(shí)認(rèn)為是過(guò)快的，并會(huì)與IIF相關(guān)。在冷凍細(xì)胞的不同焦平面上獲得的拉曼成像顯示，細(xì)胞中間（中心）的細(xì)胞色素c圖像提供了強(qiáng)的信號(hào)。臺(tái)盼藍(lán)染色陰性細(xì)胞（活細(xì)胞）的細(xì)胞色素c局部拉曼信號(hào)強(qiáng)且低Moran's I值為0.65，而臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞（死細(xì)胞）沒(méi)有可區(qū)分的細(xì)胞色素c拉曼峰。因此，可使用0.65的Moran's I值作為區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的閾值水平。

冷凍Jurkat細(xì)胞后的復(fù)蘇率與冷凍速率的函數(shù)曲線圖。（B）冷凍細(xì)胞在三個(gè)不同深度焦平面上細(xì)胞色素c的拉曼成像。（C）通過(guò)拉曼光譜檢測(cè)冷凍后Jurkat細(xì)胞的活性并使用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞色素c的拉曼特征、拉曼成像和計(jì)算的Moran's I值。

拉曼光譜可分析細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成

拉曼光譜測(cè)定了細(xì)胞在1、10和50℃/min冷凍速率下的細(xì)胞活性：以1℃/min冷凍保存后的細(xì)胞中有80%是活的，以10℃/min冷凍保存后的有60%的細(xì)胞是活的，而以50℃/min冷凍保存后的只有20%的細(xì)胞是活的。每個(gè)細(xì)胞內(nèi)冰的相對(duì)量可以根據(jù)冰的橫截面積與細(xì)胞的橫截面積的比值（Aic）來(lái)估計(jì)。Aic與不同冷凍速率相關(guān)性函數(shù)（圖4B），Aic隨著冷卻速率的增加而增加。統(tǒng)計(jì)Aic與Moran's I值的函數(shù)曲線圖，結(jié)果表明活細(xì)胞中的冰晶比死細(xì)胞少，但存在群體上的差異。

基于拉曼圖像可計(jì)算IIF的冰晶尺寸及位置

在不同冷凍速率下，大多數(shù)細(xì)胞僅存在小冰晶（<0.5 μm），并且所有存在IIF的活細(xì)胞都只具有小冰晶。在快速冷凍速率下冷凍細(xì)胞中常出現(xiàn)大冰晶（2-3μm），具有大冰晶的細(xì)胞基本會(huì)死亡。大小不同的的冰晶可能位于細(xì)胞的不同區(qū)域，小冰晶僅出現(xiàn)在細(xì)胞邊緣，而大冰晶可能位于細(xì)胞邊緣以及細(xì)胞中心。

拉曼圖像可表征冰晶、細(xì)胞膜和IIF的相互作用

分別將細(xì)胞以10℃/min的冷凍速率在10% DMSO或10% DMSO+10%葡聚糖中進(jìn)行冷凍保存。通過(guò)拉曼成像分析IIF和Aic，細(xì)胞通常存在于相鄰冰晶之間的未冷凍溶液中。實(shí)驗(yàn)觀察指定了兩個(gè)不同的區(qū)域：1）細(xì)胞外冰晶靠近細(xì)胞膜的區(qū)域；2）相鄰冰晶之間的區(qū)域，其中細(xì)胞膜遠(yuǎn)離細(xì)胞外冰晶。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞和細(xì)胞外冰晶之間的未冷凍溶液的厚度來(lái)表示細(xì)胞膜與細(xì)胞外冰晶的接近度。

拉曼驗(yàn)證破壞細(xì)胞骨架增加了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成量

質(zhì)膜不是孤立地起作用，而是與細(xì)胞中的其他結(jié)構(gòu)相互作用，特別是細(xì)胞骨架。為了確定破壞膜結(jié)構(gòu)對(duì)IIF的影響，將Jurkat細(xì)胞放置于50以及250μM細(xì)胞松弛素D（Cytochalasin D，CD）中培養(yǎng)30分鐘，然后在10% DMSO中以10℃/分鐘的速率進(jìn)行冷凍。對(duì)于存在CD的實(shí)驗(yàn)，在10個(gè)細(xì)胞中有2個(gè)中觀察到大塊冰晶。約83%的細(xì)胞靠近細(xì)胞膜存在比例很高的細(xì)胞外冰晶，其中帶有大塊冰晶的細(xì)胞確認(rèn)死亡，而帶有小冰晶的細(xì)胞部分死亡部分存活。細(xì)胞內(nèi)冰晶與細(xì)胞膜的空間定位確證在細(xì)胞外冰晶附近。在所有實(shí)驗(yàn)條件下，IIF的細(xì)胞比例相同（100%），但結(jié)果顯示Aic會(huì)隨著CD濃度的增加而增加。

此項(xiàng)研究證實(shí)了拉曼光譜技術(shù)可用于研究細(xì)胞在不同冷凍速率、不同冷凍保護(hù)劑下的冷凍反應(yīng)。此外研究還表明了IIF靠近于細(xì)胞膜，特別是與細(xì)胞外冰晶相鄰的位置。隨著靠近細(xì)胞膜且與胞外冰晶相鄰的比例增加，IIF比例也會(huì)增加，并且隨著細(xì)胞膜和胞外冰晶之間的距離減小，IIF比例也會(huì)隨之增加，這些結(jié)果表明細(xì)胞膜和細(xì)胞外冰晶之間的相互作用是造成IIF的原因。該研究還進(jìn)一步了解了冷凍保護(hù)劑的潛在作用機(jī)制，但是，研究中無(wú)法通過(guò)拉曼技術(shù)將細(xì)胞骨架與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白質(zhì)成分區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此也無(wú)法明確IIF是否會(huì)損害細(xì)胞骨架。