ADC之蛋白酶可裂解連接子

蛋白酶可裂解連接子是ADC中應用廣泛的連接子。目前已有使用該類型連接子的多個ADC藥物獲得批準，應用于治療實體瘤和血液瘤。本文就一些蛋白酶連接子的開發(fā)做一個簡單介紹。

組織蛋白酶B可切割連接子

組織蛋白酶B可切割Val-Cit連接子

鑒于為癌癥治療而開發(fā)的ADC，人們一直關(guān)注那些在腫瘤中過表達的組織蛋白酶，特別是組織蛋白酶B，因為它在哺乳動物細胞的溶酶體中含量很高。從已知的苯丙氨酸-精氨酸(Phe-Arg)二肽底物序列開始， BMS的科學家們研究了一系列封端的二肽前藥，通過二肽的羧基連接到DOX的氨基上，以被組織蛋白酶B切割，并在人體血漿中保持穩(wěn)定。由于DOX被認為太大，不適合組織蛋白酶B的活性部位，研究者加入了對氨基苯氧羰基(PABC)間隔區(qū)，用于酰胺鍵的酶促裂解時的自焚碎裂和藥物釋放。

后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)在用于MMAE連接的不同組織蛋白酶B可切割連接子中，帶有Val Cit-PABC連接子的ADC在效價、特異性、血漿穩(wěn)定性和體內(nèi)藥效方面表現(xiàn)出佳的性能。這些發(fā)現(xiàn)為進入臨床研究的第二代ADC的開發(fā)提供了基礎(chǔ)，并導致幾種ADC藥物獲得成功批準，包括血液腫瘤和實體腫瘤。Brentuximab vedotin (Adcetris)是一種以Val-Cit-PABC接頭和MMAE為有效載荷的抗CD30 ADC，被批準用于表達CD30的復發(fā)性霍奇金淋巴瘤、全身性間變性大細胞淋巴瘤和外周T細胞淋巴瘤。在批準用于彌漫性大B細胞淋巴瘤的抗CD79b-Val-Cit-PABC-MMAE ADC(polatuzumab vedotin，Polivy)中使用了相同的接頭和有效載荷設(shè)計，并與苯達莫司汀和利妥昔單抗聯(lián)合使用?？筃ectin-4 Val-Cit PABC-MMAE ADC(enfortomab vedotin，Padcevs)也含有相同的連接子，并已被批準用于轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌。抗組織因子(TF) Val-Cit-PABC-MMAE ADC （tisotumab vedotin），被批準用于宮頸癌。

Val-Cit-PABC-MMAE ADC的有效載荷過早釋放

2011年，由Seagen開發(fā)的第一個ADC Adcetriss成功獲得批準后，研究者對組織蛋白酶可切割的Val-Cit-PABC接頭進行了更詳細的研究。在早期的研究中，組織蛋白酶可切割的cBR96 ADC在人血漿中具有很高的穩(wěn)定性(Val-Cit 的半衰期為 230 天，Phe-Lys的半衰期為 80 天)。然而，在小鼠血漿中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性較低(Val-Cit的半衰期為30天，Phe-Lys的半衰期為12.5天)。這種不穩(wěn)定性在活體小鼠模型中更加明顯，但在猴子或人類身上尚未見過。對各種酶抑制劑的廣泛研究、蛋白質(zhì)組學研究以及對基因敲除小鼠的研究表明，小鼠血漿中過早釋放有效載荷相關(guān)的Val-Cit連接子不穩(wěn)定的原因是羧酸酯酶1c(Ces1c)，而不是組織蛋白酶B。

科學家對Ces1c結(jié)合位點的更深入研究揭示了一條改進切割序列的設(shè)計。Ces1c的催化部位在一個狹窄的口袋深處，而組織蛋白酶B的活性部位在一個較淺的口袋。若ADC的切割序列與P3氨基末端的極性氨基酸的延長則可以消除Ces1c由于活性部位不可及而被Ces1c切割，而組織蛋白酶B的切割完全保留。當使用谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸時，這種影響為明顯，這表明負電荷有效地排斥了Ces1c酶。在HER2陽性的KPL-4和JIMT-1乳腺癌移植小鼠模型中，與Val-Cit連接子HER2-ADC相比，Glu-Val-Cit連接子ADC增強了小鼠的血漿穩(wěn)定性，提高了JIMT-1乳腺癌移植模型的體內(nèi)藥效。

在另一種提高組織蛋白酶B可切割ADC的血漿穩(wěn)定性的方法中，研究了修飾自焚間隔基部分的影響，這些努力導致了me[x]ta-amide PABC基團的鑒定，該基團產(chǎn)生了具有改善的小鼠血清穩(wěn)定性的連接子。如果在mata部位使用聚乙二醇組分，還可以降低疏水性，而不會對組織蛋白酶B所需的蛋白水解性切割產(chǎn)生負面影響。 Agensys的研究人員調(diào)查了引起中性粒細胞減少的潛在原因，這是癌癥患者的一種常見不良事件。研究發(fā)現(xiàn)，具有釋放MMAE有效載荷的可切割Val-Cit-PABC連接子的ADC會在不依賴抗體和靶點的情況下導致患者中性粒細胞減少，而接受MMAF通過非切割馬來胺異丙基連接子(mc-MMAF)治療的ADC患者中性粒細胞減少并不明顯。因此，研究者研究了帶有可切割連接子的ADC(vc-PABC-MMAE)釋放具有旁觀者效應的有效載荷和具有不可切割連接子的ADC(mc-MMAF)釋放沒有旁觀者影響的有效載荷對中性粒細胞分化的影響。所調(diào)查的ADC針對的是中性粒細胞上未表達的抗原，如ENPP3、SLC44A4。研究發(fā)現(xiàn)可切割的vc-PABC-MMAE ADC對分化為中性粒細胞的HSCs的細胞毒作用強于與相同的抗體通過不可切割的mc-MMAF有效載荷連接的ADC。這歸因于中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)對可切割的Val-Cit連接子進行胞外裂解，隨后釋放出游離的MMAE有效載荷，由于其旁觀者效應，對中性粒細胞是有毒的。vc-PABC-MMAE的切割可被絲氨酸蛋白酶抑制劑阻斷，但不能被半胱氨酸蛋白酶抑制劑阻斷。綜上所述，中性粒細胞分化所分泌的絲氨酸蛋白酶能夠在循環(huán)中釋放細胞通透性的MMAE，對中性粒細胞具有細胞毒作用，從而可能導致這種Val-Cit-PABC-MMAE ADC引起的中性粒細胞減少癥。 這些發(fā)現(xiàn)可能為增加可切割ADC的治療窗口提供機會，方法是設(shè)計對某些溶酶體半胱氨酸蛋白酶(如組織蛋白酶B)而不是絲氨酸蛋白酶(如中性粒細胞彈性蛋白酶)具有更高特異性的連接子。

組織蛋白酶B背后隱藏的切割力量

Genentech的研究人員闡明了在使用同向異構(gòu)體和基因敲除小鼠時，Val-Cit-PABC-MMAE ADCs分解代謝和代謝物形成的其他機制。 在HER2陽性的KPL-4細胞中通過CRISPR/Cas9介導的組織蛋白B基因的缺失或在CD22陽性的淋巴瘤細胞系WSU-DLCL2和BJAB中通過shRNA敲除來抑制組織蛋白酶B的表達，但這對抗HER2或抗CD22 Val-Cit-PABC-MMAE ADCs的療效沒有影響。這是一個明確的暗示，其他酶可以補償組織蛋白酶B活性的損失，以釋放MMAE。用純化的組織蛋白酶B、K、L和S進行生化切割分析表明，不僅組織蛋白酶B而且組織蛋白酶S也能有效地切割Val-Cit-PABC-MMAE ADC。

組織蛋白酶B特異性切割的ADC設(shè)計

由于含有Val-Cit多肽連接子易被多種酶如組織蛋白酶B、組織蛋白酶S、Ces1c和中性粒細胞彈性蛋白酶切割，Genentech和Spigen的研究人員致力于提高該多肽連接子對組織蛋白酶B切割的特異性。 通過采用結(jié)構(gòu)驅(qū)動的方法來開發(fā)組織蛋白B高特異性切割的模擬肽連接子，他們從組織蛋白酶B活性部位的半胱氨酸殘基Cys-29共價結(jié)合的二肽基腈抑制劑的結(jié)構(gòu)信息和一個簡化的模型系統(tǒng)出發(fā)，提出了一種含有環(huán)丁烷-1，1-二甲酰胺(cBU)部分的具有所需性質(zhì)的模擬肽連接子。這種含cBU-Cit的ADC的胞內(nèi)切割被組織蛋白酶B抑制劑特異性抑制75%，被廣譜蛋白酶抑制劑抑制90%。相反，含有Val-Cit的ADC的切割只能用廣譜的蛋白酶抑制劑來抑制。因此， cBU-Cit部分對組織蛋白酶B的切割更具特異性。
 

四肽連接子Gly-Gly-Phe-Gly

繼Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)在2013年獲得批準后，研究者進行了其他的嘗試，以探索具有不同連接子和不同有效載荷的曲妥珠單抗ADC。其中具有代表性的下一代HER2 ADC是trastuzumab deruxtecan DS-8201a (Enhertus)，由DNA拓撲異構(gòu)酶I抑制劑deruxtecan(DXd) 通過蛋白酶可切割接頭連接到HER2 mAb。該ADC通過馬來酰亞胺丙基構(gòu)建塊連接到抗體的四個鏈間二硫鍵還原后的半胱氨酸殘基上，導致DAR為7.7。其應用的連接子由Gly-Gly-Phe-Gly部分和自焚的氨基-甲氧基間隔基組成。四肽連接子可以被組織蛋白酶B和L切割，然后自焚氨基以釋放活性有效載荷DXd。體外和體內(nèi)研究表明，DS-8201a在血漿中具有很高的穩(wěn)定性。DS-8201a已被FDA批準用于治療無法手術(shù)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的成年患者以及用于治療HER2陽性的轉(zhuǎn)移性胃癌患者。
Legumain（LGMN）可裂解連接子  
LGMN，是半胱氨酸蛋白酶家族的成員，在豆科植物種子中發(fā)現(xiàn)。1997年，LGMN也從哺乳動物中被克隆出來。它首先表達為pro-LGMN，然后經(jīng)歷pH依賴的自我催化，產(chǎn)生活性的LGMN內(nèi)肽酶。酸性的pH對于LGMN酶的活性是必不可少的。LGMN 主要定位于內(nèi)體溶酶體區(qū)室和溶酶體，兩者都具有所需的酸性 pH 值，但在細胞外空間也檢測到 LGMN。由于TME是以酸性pH為特征的，因此LGMN可能既有細胞活性，又有一定的細胞外活性。LGMN是已知的一種在ASN殘留后特異性切割的哺乳動物蛋白酶?；诿庖呓M織化學數(shù)據(jù)，LGMN已被證明在多種腫瘤類型中過度表達，例如在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中。 拜耳公司的科學家開發(fā)了一種新的連接技術(shù)，利用與腫瘤相關(guān)的溶酶體蛋白水解酶LGMN作為切割酶，用于ADC。
研究者設(shè)想，在腫瘤中的過度表達和天冬酰胺后高度選擇性的切割位點可以提高腫瘤的特異性，從而增加ADC的治療窗口。 研究發(fā)現(xiàn)LGMN也可以在腫瘤間質(zhì)中的細胞外切割，但由于LGMN活性的適pH約為4.5-5.5，因此在腫瘤間質(zhì)中的藥物釋放是次優(yōu)的。較高的LGMN豐度，以及溶酶體內(nèi)的酸性pH，為LGMN的活性提供了的環(huán)境，確實可以顯示出高效的藥物釋放。 Lerchenet等人研究了ADC以及具有不同肽連接子的小分子化合物作為潛在的LGMN底物。首先，Lerchenet等人探索了具有已知LGMN底物序列丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(ALA-ALA-ASN)的ADC，該序列顯示出對靶向表達的癌細胞株的高活性。
為了避免非LGMN介導的切割，例如在連接子中的丙氨酸殘基之后，中心丙氨酸殘基被非天然的D-丙氨酸或N-methyl丙氨酸取代。這兩種ADC的體外活性與由氨基酸組成的ADC活性相似。甚至完全去除ALA-ALA二肽也是可以接受的。而且研究發(fā)現(xiàn)這種新型ADC對組織蛋白酶B和中性粒細胞彈性蛋白酶具有較高的穩(wěn)定性。

ADC的胞外激活連接子  

細胞外組織蛋白酶可裂解的ADC

為了探索非內(nèi)化抗原是否可以用來靶向TME或腫瘤內(nèi)皮細胞, 已選擇高度特異性表達的非內(nèi)化腫瘤抗原, 例如Tenascin剪接變異體、CD21。 Gebleuxet等人使用了針對非內(nèi)化抗原tenascin的剪接異構(gòu)體tenascin-C的F16抗體 ADC。在皮下移植的A431(人表皮樣癌)和U87(人胃癌)異種小鼠模型中，F(xiàn)16-Val-Cit-PABC-MMAE在這兩個模型中都產(chǎn)生了CR。Ex vivo顯微鏡分析顯示，抗體F16優(yōu)先富含抗原(Tenascin-C)的腫瘤內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)。 用含有Val-Cit-PABC-MMAF的ADC靶向內(nèi)化能力很差的抗原CD21在臨床前淋巴瘤模型沒有殺傷效果，而同一抗體與Val-Cit-PABC-MMAE的偶聯(lián)則顯示出很強的抗腫瘤活性。這表明，不依賴通過抗原結(jié)合內(nèi)化的細胞外組織蛋白酶切割機制也正在發(fā)揮著作用。
 

基質(zhì)金屬蛋白酶

描述了一種雙標記ADC，能夠通過不同的切割機制釋放兩種不同的熒光標記：一種結(jié)合物含有可被細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)切割的肽序列Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly，另一種結(jié)合物包含經(jīng)典的Val-Cit-PABC連接子，它可以被組織蛋白酶B切割。已在可被不同MMP切割的多肽的篩選中鑒定了MMP-2切割序列Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly。由于Val-Cit-PABC已成功應用于幾個批準并上市的ADC，而Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly連接子迄今僅用于聚合物藥物結(jié)合物。我們相信可被胞外MMP-2切割的序列有望用于ADC連接子的重要組成部分。
小  結(jié)  
蛋白酶可裂解連接子已成功用于ADC的藥物開發(fā)。組織蛋白酶可裂解連接子是目前應用廣泛以及研究深入的。對組織蛋白酶切割機制的廣泛研究使人們更好地了解了切割生物學和連接子的設(shè)計。由于穩(wěn)定性和特異性的增加，可能導致治療窗口的增強。為了促進腫瘤特異性有效載荷釋放，天冬酰胺后具有獨特切割序列的腫瘤相關(guān)蛋白酶LGMN也已經(jīng)被探索，相關(guān)的ADC也正在開發(fā)中。針對腫瘤微環(huán)境中蛋白酶切割的連接子也在開發(fā)中，也許通過利用腫瘤微環(huán)境的特性激活ADC，可以增強ADC的腫瘤選擇性以及發(fā)揮更大的藥效?？偠灾鞍酌缚闪呀膺B接子的發(fā)展已經(jīng)逐漸成熟，這為ADC的成功奠定了重要基礎(chǔ)。