干細(xì)胞治療缺血性中風(fēng)的研究進(jìn)展

卒中（中風(fēng)）是世界上一種會(huì)致殘性的、甚至危及生命的疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。缺血性中風(fēng)約占全球所有中風(fēng)的79%。據(jù)估計(jì)，每4個(gè)成年人中就有1個(gè)會(huì)經(jīng)歷中風(fēng)，全世界有超過(guò)8000萬(wàn)不同程度殘疾的中風(fēng)幸存者，中風(fēng)嚴(yán)重影響了這些患者的生活質(zhì)量。因此，為了降低死亡率和致殘率，尋找有效的治療方案勢(shì)在必行。 缺血性中風(fēng)，是全球范圍內(nèi)的高發(fā)疾病，歐洲為嚴(yán)重。

缺血性中風(fēng)導(dǎo)致大腦中的缺氧和葡萄糖缺乏，缺氧缺糖引起的線(xiàn)粒體功能障礙發(fā)生在缺血后的幾分鐘內(nèi)，導(dǎo)致ATP產(chǎn)生耗竭和活性氧簇（ROS）的過(guò)量產(chǎn)生，啟動(dòng)了大腦多個(gè)組織細(xì)胞死亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)釋放促炎細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，從而破壞血腦屏障，使得外周炎癥細(xì)胞（包括中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞）進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，增加神經(jīng)細(xì)胞死亡。 通過(guò)腦血管造影可以確定血栓的位置，從而及時(shí)處理。

目前可用的缺血性中風(fēng)治療方法是通過(guò)溶栓/取栓，從而讓血管內(nèi)再通以恢復(fù)血流，減少腦神經(jīng)細(xì)胞因缺血所致的死亡，從而減少殘疾和死亡，但都有時(shí)間的限制性。以間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）為基礎(chǔ)的治療被普遍認(rèn)為是中風(fēng)的新療法，并已逐漸相續(xù)開(kāi)展臨床試驗(yàn)[4]。MSC因其易獲得性、分泌多種生長(zhǎng)因子、免疫調(diào)節(jié)特性和具有穿透血管的能力，而成為治療缺血性卒中的一個(gè)有吸引力的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞選擇[5]。

1，MSC治療缺血性中風(fēng)的機(jī)制分析

中風(fēng)時(shí)的血流阻斷會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的病理生理過(guò)程，包括氧化應(yīng)激、炎癥、血腦屏障的破壞、鈣超載、興奮性毒性和自噬功能障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷出現(xiàn)的癥狀[2, 6]。隨后的血流再通也會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，即再灌注損傷。氧化應(yīng)激和炎癥活動(dòng)是腦缺血損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的兩個(gè)早期事件，導(dǎo)致許多神經(jīng)細(xì)胞的損傷和神經(jīng)傳遞的中斷[7-9]。自噬作為清道夫，在腦缺血時(shí)也被激活，對(duì)缺血性卒中起雙相作用，適當(dāng)?shù)淖允捎兄诰S持大腦新陳代謝，而自噬失衡會(huì)加劇腦損傷。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和自噬功能障礙共同作用于腦缺血后的細(xì)胞損傷，這三個(gè)關(guān)節(jié)的環(huán)節(jié)同時(shí)也是MSC治療缺血性中風(fēng)的機(jī)制靶點(diǎn)。但是這三個(gè)環(huán)節(jié)缺少了腦血管這個(gè)很重要的影響因素。

活性氧和活性氮的大量產(chǎn)生還可直接引發(fā)炎癥分子的分泌和炎性小體的激活，從而對(duì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生有害影響，如細(xì)胞器腫脹和壞死、脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA修飾異常，同時(shí)改變血管反應(yīng)性和破壞血腦屏障。因此，中風(fēng)患者的血腦屏障的通透性是增加的，這一點(diǎn)有利于MSC較為容易地通過(guò)血腦屏障。非常奇怪的是，這一點(diǎn)常常被臨床研究者或者M(jìn)SC研究者所忽視，以至于想當(dāng)然地認(rèn)為MSC無(wú)法通過(guò)“血腦屏障”的限制。在動(dòng)物模型中，MSC已被證明可以跨越血腦屏障，改善急性缺血性中風(fēng)后的功能恢復(fù)。

機(jī)制之一：減少炎癥

一般說(shuō)來(lái)，MSC產(chǎn)生的抗炎分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)特性。中風(fēng)后早期應(yīng)用MSC上調(diào)了抗炎因子IL-10、IL-1RA、PGE2和TSG-6的表達(dá)水平，降低了腦組織中炎癥因子TNF-α的水平。 這些有益的作用與許多過(guò)程的調(diào)節(jié)有關(guān)，包括抗炎分子分泌增加，伴隨著促炎細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞的減少，以及修復(fù)血腦屏障。MSC修復(fù)血腦屏障的另一個(gè)途徑是通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)，通過(guò)p38信號(hào)通路下調(diào) 蛋白aquaporin-4（AQP4）的表達(dá)，減少缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。MSC可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平來(lái)挽救受損的腦組織細(xì)胞，避免神經(jīng)細(xì)胞的死亡。MSC還可以通過(guò)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的合成來(lái)減輕腦缺血再灌注損傷。適當(dāng)?shù)淖允苫钚酝ㄟ^(guò)減少氧化應(yīng)激和炎癥活動(dòng)有助于腦的恢復(fù)，而自噬功能障礙則會(huì)加重腦損傷。因此，MSC可以通過(guò)增強(qiáng)自噬來(lái)對(duì)抗缺血性損傷。其中BDNF/mTOR信號(hào)通路、PI3K/Akt/mTOR通路和Notch2/mTOR通路也參與了MSCs促進(jìn)自噬的調(diào)控過(guò)程。也有證據(jù)表明，MSC能夠通過(guò)多種分子途徑抑制自噬，進(jìn)而促進(jìn)缺血損傷后的功能恢復(fù)。研究多的是MSC激活mTOR通路的能力，包括PI3K/Akt/mTOR通路和PTEN/Akt/mTOR通路。在缺血性中風(fēng)發(fā)作后的早期30min后，出現(xiàn)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）活性增強(qiáng)，及BAG3/BAG1和LC3-II/LC3-I比值在再灌注24h均增加；腦內(nèi)注射MSC減少細(xì)胞的凋亡，抑制了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）的活性，提高BAG3/BAG1和LC3-II/LC3-I比值，從而縮小腦梗死體積。  

機(jī)制之二：拯救受傷的神經(jīng)細(xì)胞

不管是出血性中風(fēng)，還是缺血性中風(fēng)，臨床治療都是要盡量避免神經(jīng)細(xì)胞的死亡，從而減少因神經(jīng)細(xì)胞死亡導(dǎo)致的致殘或致死。   短暫性局灶性腦缺血誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞線(xiàn)粒體進(jìn)入鄰近神經(jīng)元，促進(jìn)了受傷的神經(jīng)元細(xì)胞的存活。細(xì)胞間線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移給受損的神經(jīng)元細(xì)胞，這代表了一種治療缺血性中風(fēng)的新策略，它促進(jìn)了受損細(xì)胞的神經(jīng)活性、軸突再生長(zhǎng)和其他功能恢復(fù)。而MSC來(lái)源的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移更是治療缺血性中風(fēng)的一種新方法。

大鼠實(shí)驗(yàn)證明MSC介導(dǎo)的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移給受傷的神經(jīng)細(xì)胞，提高了干細(xì)胞療法對(duì)受損大腦的治療效果，更好地促進(jìn)了中風(fēng)后的康復(fù)。在MSC中增加Miro1的表達(dá)可以提高線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率。給大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）的缺血大鼠的腦室內(nèi)補(bǔ)充健康的人臍帶MSC的線(xiàn)粒體，減少了受損神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少了星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而減輕腦缺血后的再灌注/缺血所致的腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，縮小了梗死面積，改善了運(yùn)動(dòng)功能。MSC能夠通過(guò)形成TNTs/GAP連接、囊泡轉(zhuǎn)移或細(xì)胞融合，將健康的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移到受損細(xì)胞，從而產(chǎn)生ATP，減輕炎癥反應(yīng)，減少凋亡，挽救受損神經(jīng)元。給受損的細(xì)胞補(bǔ)充線(xiàn)粒體將是治療中風(fēng)的一種有前途的方法，而健康的MSC是用于治療缺血性中風(fēng)的線(xiàn)粒體的很好來(lái)源。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的碎片化線(xiàn)粒體可以觸發(fā)A1星形細(xì)胞反應(yīng)并擴(kuò)散炎性神經(jīng)變性。因此，在線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移治療中盡可能保持線(xiàn)粒體的完整性。然而，來(lái)自不同組織來(lái)源MSC的線(xiàn)粒體表現(xiàn)出不同的特性，脂肪和骨髓來(lái)源的MSC的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移率高于牙髓和臍帶來(lái)源的MSC，但是牙髓和臍帶來(lái)源的MSC在抑制細(xì)胞在應(yīng)激下產(chǎn)生的活性氧水平比脂肪和骨髓的MSC更有效。除了線(xiàn)粒體，MSC還可能通過(guò)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和血管生成因子傳遞給受傷的神經(jīng)細(xì)胞，傳遞方式主要胞外囊泡（外泌體），這些因子包括VEGF、BDNF、NGF、bFGF和IGF-1等。早些研究?jī)A向于MSC通過(guò)細(xì)胞因子的方式拯救受傷的神經(jīng)細(xì)胞，但是現(xiàn)在越來(lái)越多的研究集中于MSC向受傷的神經(jīng)細(xì)胞輸送線(xiàn)粒體，如前所述。

機(jī)制之三：重建血供和修復(fù)血腦屏障

缺血性中風(fēng)的病理變化中，常常是腦血管被堵塞或者細(xì)小血管塌陷了。治療缺血性中風(fēng)的首要任務(wù)是通過(guò)溶栓/取栓，從而讓血管內(nèi)再通以恢復(fù)血流，從而減少腦神經(jīng)細(xì)胞因缺血所致的死亡。

毛細(xì)血管管道由內(nèi)皮細(xì)胞組成，周細(xì)胞附在內(nèi)皮細(xì)胞旁邊，周邊被基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)包裹著。成年的血管和內(nèi)皮細(xì)胞處于一個(gè)靜止的狀態(tài)，很少激活形成新的分支?；啄ず椭芗?xì)胞阻止內(nèi)皮細(xì)胞離開(kāi)原本的位置，起到穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)的作用。低氧和炎癥環(huán)境這些特異性的刺激能啟動(dòng)血管新生的程序。周細(xì)胞的離開(kāi)和基質(zhì)基底膜的降解，導(dǎo)致小血管的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，增加血管的滲透性。如果沒(méi)有周細(xì)胞的黏附，有功能的新生血管將變得不穩(wěn)定，而且能快速消失。   缺血性疾病難于完全恢復(fù)的主要原因也是血管生成的不完全刺激（刺激強(qiáng)度不夠），比如動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、心梗、慢性損傷。不同來(lái)源的MSC均能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，包括臍帶、羊膜、脂肪、牙髓和骨髓。MSC不僅能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)，而且能穩(wěn)定這種新生的血管并促進(jìn)成熟，這種作用依賴(lài)于MSC和內(nèi)皮細(xì)胞的直接相互接觸，MSC發(fā)揮著類(lèi)似周細(xì)胞的角色。  
更多的證據(jù)提示MSC治療中風(fēng)是通過(guò)減輕炎癥、抑制損傷細(xì)胞的凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)形成和血管生成，而且MSC分泌的促血管新生的細(xì)胞因子起到關(guān)鍵的作用 。在MSC分泌的胞外囊泡的內(nèi)容物中，miRNAs是一種內(nèi)源性表達(dá)的小片段RNA分子，功能是調(diào)節(jié)信使RNA（mRNA）的翻譯，同樣被發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)缺血性中風(fēng)損傷的病理過(guò)程。這些miRNAs主要參與減少神經(jīng)炎癥、ROS產(chǎn)生以及BBB功能障礙，促進(jìn)血管生成。因此，miRNAs療法為腦缺血損傷的血腦屏障的修復(fù)和腦血管重建提供了一種有吸引力的候選方法。  

2，MSC治療缺血性中風(fēng)的臨床研究

2005年全球開(kāi)展了自體骨髓MSC治療缺血性中風(fēng)（亞急性期）的一項(xiàng)I/II期試驗(yàn)，在該試驗(yàn)中，5名患者在中風(fēng)后5-7周的時(shí)候進(jìn)行了靜脈輸注了1億個(gè)培養(yǎng)擴(kuò)增的自體骨髓MSC，與對(duì)照組的25名患者相比，接受MSC治療的患者在移植后3、6和12個(gè)月表現(xiàn)出持續(xù)的神經(jīng)學(xué)改善。同一研究小組隨后進(jìn)行了一項(xiàng)大規(guī)模的雙盲臨床試驗(yàn)，包括16名MSC治療患者和36名對(duì)照患者；每次注射5x107MSC，相隔2周再次注射一次同等劑量；與對(duì)照組相比，MSC治療的患者顯示出更好的功能恢復(fù)率和更低的死亡率。  
隨后的2011年日本的一個(gè)團(tuán)隊(duì)報(bào)告了對(duì)12例缺血性灰質(zhì)、白質(zhì)和混合性病變患者的MSC治療研究，患者卒中后36-133天靜脈注射自體骨髓MSC，沒(méi)有觀(guān)察到任何中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、異常細(xì)胞生長(zhǎng)或神經(jīng)惡化，也沒(méi)有證據(jù)表明任何接受干細(xì)胞輸注的患者出現(xiàn)靜脈血栓栓塞、全身惡性腫瘤或全身感染；在細(xì)胞輸注后1周，磁共振成像評(píng)估的平均病變體積減少了20%以上。也有研究團(tuán)隊(duì)顯示缺血性中風(fēng)患者自體骨髓MSC兩次注射（每次2.5x106/kg，相隔1周）并沒(méi)有帶來(lái)功能或神經(jīng)上的差異。  
在迄今為止規(guī)模大的MSC臨床試驗(yàn)（涉及英國(guó)和美國(guó)33個(gè)治療中心），2011-2015年，67例中重度缺血性中風(fēng)患者（急性期）進(jìn)入MSC治療組，靜脈注射異體骨髓12億MSC（Athersys公司提供MultiStem產(chǎn)品），在治療后90天時(shí)，治療組和對(duì)照組的患者在神經(jīng)功能恢復(fù)方面沒(méi)有差異。但是，美國(guó)Stemedica公司開(kāi)展經(jīng)過(guò)低氧培養(yǎng)的骨髓MSC（1.5x106/kg）治療慢性缺血性中風(fēng)的臨床研究，在6個(gè)月時(shí)Barthel指數(shù)評(píng)分增加6.8±11.4分（P=0.002），12個(gè)月時(shí)增加10.8±15.5分（P<0.0 5），功能恢復(fù)良好（Barthel評(píng)分≥95）的患者比例從基線(xiàn)的11.4%上升到6個(gè)月的27.3%和12個(gè)月的35.5%；這些數(shù)據(jù)證明了靜脈輸注異體骨髓低氧培養(yǎng)的MSC治療慢性卒中患者和實(shí)質(zhì)性功能缺陷患者的安全性和有效性。  
2020年報(bào)道了法國(guó)領(lǐng)銜了一項(xiàng)單中心多團(tuán)隊(duì)參與、開(kāi)放標(biāo)簽的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，隨訪(fǎng)時(shí)間為2年，評(píng)價(jià)靜脈注射自體骨髓MSC治療缺血性中風(fēng)（亞急性期）的安全性、可行性和有效性；在31名登記的患者中，16名患者接受了骨髓MSC，在6個(gè)月和2年的隨訪(fǎng)中，治療組分別有10和16個(gè)不良事件發(fā)生，對(duì)照組分別有12和24個(gè)不良事件發(fā)生；MSC治療對(duì)Barthel指數(shù)、NIHSS和Modified-Rankin評(píng)分沒(méi)有影響，但在運(yùn)動(dòng)相關(guān)的NIHSS、Fugl-Meyer評(píng)分和相關(guān)功能磁共振活動(dòng)方面有改善。

除了靜脈注射治療卒中，一項(xiàng)I/IIa期試驗(yàn)開(kāi)展局部腦注射MSC治療慢性卒中，在該試驗(yàn)中18名慢性患者（卒中后6個(gè)月至3年）接受了2.5、5或1000萬(wàn)個(gè)經(jīng)過(guò)Notch-1基因修飾的異體骨髓MSC（SB623）的立體定向顱內(nèi)注射（每個(gè)劑量組6名患者），圍繞梗死灶的立體定向影像引導(dǎo)注射5次，在3、6、12和24個(gè)月后，神經(jīng)功能有了的改善。經(jīng)大腦中動(dòng)脈M1段單次注入臍帶MSC（2x107/每人），三名缺血性中風(fēng)患者中有兩名顯示出肌肉力量的改善，2例患者在治療90天和180天后觀(guān)察到改良Rankin評(píng)分的改善。小樣本臨床研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在亞急性期內(nèi)給與單獨(dú)靜脈注射臍帶MSC或鞘內(nèi)注射MSC聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞，均可以改善缺血性中風(fēng)患者的神經(jīng)功能、殘疾程度和日常生活能力。  

3，總結(jié)和展望

對(duì)腦缺血-再灌注損傷涉及復(fù)雜的信號(hào)通路來(lái)破壞細(xì)胞，包括氧化應(yīng)激、炎癥活動(dòng)和自噬功能障礙等等。目前，MSC在實(shí)驗(yàn)性缺血性中風(fēng)的治療中表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激、減輕神經(jīng)炎癥和調(diào)節(jié)自噬的功效，其中大部分得益于其強(qiáng)大的旁分泌活性。更重要的是，MSC的低免疫原性、跨過(guò)血腦屏障的能力、靶向基因藥物的輸送能力，使得MSC以及其來(lái)源的外泌體在缺血性中風(fēng)的臨床治療中有著廣闊的前景。  
提高M(jìn)SC的向大腦的趨化能力，同樣有利于提高M(jìn)SC的治療效果。比如，涂抹在細(xì)胞膜上的棕櫚酸多肽可以將MSC定向到缺血組織，從而減少細(xì)胞在周?chē)鞴僦械姆e聚，增加細(xì)胞在靶組織中的植入率。隨著細(xì)胞歸巢功能的增強(qiáng)，MSC可以攜帶miR-133b，從而提高缺血損傷中miR-133b的表達(dá)水平，進(jìn)一步提高缺血性腦中風(fēng)的治療效果。似乎急性期靜脈或動(dòng)脈內(nèi)移植，目的是減輕全身和局部炎癥，減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡，但不需要細(xì)胞植入；腦內(nèi)注射是慢性期，因?yàn)樵诼云趦?nèi)，干細(xì)胞植入被認(rèn)為是細(xì)胞治療的目標(biāo)。大腦中動(dòng)脈阻塞建立缺血性中風(fēng)大鼠模型后，第7天通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)、靜脈或腦內(nèi)途徑注射骨髓MSC，結(jié)果顯示經(jīng)動(dòng)脈、靜脈和腦內(nèi)途徑移植的MSC治療組較對(duì)照組有更大的神經(jīng)功能改善，而且動(dòng)脈內(nèi)注射MSC組的疾病大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的程度和速度快。

但是，需要明確的是，不管MSC是局部注射還是靜脈注射，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明MSC進(jìn)入體內(nèi)后并不能長(zhǎng)期存留，所以MSC在大腦的位置并不能分化為神經(jīng)細(xì)胞，也就是說(shuō)神經(jīng)細(xì)胞一旦死亡，MSC并不能起到替代的作用。簡(jiǎn)而言之，MSC治療慢性中風(fēng)的效果會(huì)很差，只能祈禱奇跡的出現(xiàn)。我們需要銘記一些生命科學(xué)相關(guān)的常識(shí)，比如人死不能復(fù)生，神經(jīng)細(xì)胞死了也不能復(fù)生，所以是在人和細(xì)胞死亡之前給予拯救。 MSC治療缺血性中風(fēng)，和MSC治療其他疾病一樣，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)優(yōu)化治療方案，包括細(xì)胞類(lèi)型的選擇、細(xì)胞質(zhì)量的評(píng)價(jià)、細(xì)胞劑量和患者內(nèi)在特征的參數(shù)對(duì)MSC的影響等等。
溫馨建議：中風(fēng)發(fā)生后，建議在急性期用干細(xì)胞干預(yù)治療，大概率可以避免神經(jīng)細(xì)胞的死亡，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。