μCellect-新型的噬菌體展示平臺(tái)

噬菌體展示技術(shù)是一種被廣泛使用的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)，在抗體發(fā)現(xiàn)過程中，噬菌體抗體庫(kù)的篩選是為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，將文庫(kù)內(nèi)的噬菌體與靶標(biāo)孵育，未結(jié)合的噬菌體，擴(kuò)增結(jié)合的噬菌體，得到具有親和力和特異性的克隆組成的亞庫(kù)，再?gòu)闹泻Y選單個(gè)克隆，并轉(zhuǎn)化為IgG形式，用于診斷或治療試劑。

目前廣泛使用的篩選方法有很多，但是傳統(tǒng)的篩選技術(shù)也存在著很多局限性，例如篩選周期長(zhǎng)，篩選得到的抗體特異性以及親和力不夠高等問題。 針對(duì)這些問題，David N. Philpott等人提出了μCellect方法，該方法使用的是一種低成本（<50美元/芯片）、高通量(>107cells/h)的細(xì)胞分選器（MICS)，原始噬菌體文庫(kù)與少數(shù)表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞和大量缺乏目標(biāo)抗原的細(xì)胞共同孵育后，用捕獲探針所特有的磁性納米顆粒(MNPs)標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，目標(biāo)細(xì)胞通過一組傾斜的導(dǎo)向器進(jìn)行橫向偏轉(zhuǎn)，以平衡Stokes的阻力（來自流體流動(dòng)）和磁力（來自MNPs）。繼而開始進(jìn)行分選。洗脫目標(biāo)細(xì)胞得到噬菌體，并擴(kuò)增得到噬菌體亞庫(kù)，重復(fù)這個(gè)過程進(jìn)行迭代富集，并且將所有的子庫(kù)進(jìn)行NGS測(cè)序。為驗(yàn)證該方法的適用性，本文介紹了以針對(duì)Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵配體人Frizzled-7的抗體篩選的過程以及結(jié)果。 

1、微流控細(xì)胞分選（MICS)平臺(tái)試驗(yàn)

該試驗(yàn)使用帶有GFP內(nèi)部的外源性myc標(biāo)簽以區(qū)分共表達(dá)人Fzd7的目標(biāo)細(xì)胞和陰性細(xì)胞，使用MICS設(shè)備分選之后，發(fā)現(xiàn)超過90%的myc+細(xì)胞被捕獲，結(jié)果表明噬菌體結(jié)合對(duì)細(xì)胞捕獲的影響小，之后，為了檢測(cè)可在MICS裝置上分辨出陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的比例，將目標(biāo)細(xì)胞加入到非抗原表達(dá)的細(xì)胞中，并對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)記和分類，發(fā)現(xiàn)在靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞的比例為1：200時(shí)，細(xì)胞幾乎都被回收了，通過比較不同比例下細(xì)胞的分選效果，因此選擇了1：20的比例來進(jìn)行篩選。使用與噬菌體展示應(yīng)用程序相關(guān)的指標(biāo)，將MICS平臺(tái)的性能與其他技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比測(cè)試。發(fā)現(xiàn)磁激活細(xì)胞分選(MACS)具有與MICS相當(dāng)?shù)耐?，但結(jié)合的噬菌體在分選過程中會(huì)丟失，熒光激活細(xì)胞分選(FACS)具有與MICS相似的噬菌體回收率，但處理大細(xì)胞群時(shí)的速度很緩慢。

4、克隆的驗(yàn)證

將篩選獲得的候選CDR序列還原為IgG1形式，并進(jìn)行表達(dá)、純化和定量。評(píng)估候選克隆結(jié)合Fzd7+myc+和myc+細(xì)胞的能力。同時(shí)將野生型CHO細(xì)胞作為非特異性結(jié)合的對(duì)照。采用OMP18R5(IgG2形式)作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示三種候選克隆(ML7、ML8和ML9)對(duì)Fzd7+myc+靶細(xì)胞系表現(xiàn)出高特異的親和力。其他候選克隆對(duì)靶細(xì)胞系的親和力低。結(jié)果表明，k-means算法得分高低比分群大小更能決定候選克隆的親和力。對(duì)ML7、ML8和ML9進(jìn)行的分析顯示，ML9的EC50值和對(duì)Fzd7的解離常數(shù)(Kd)都與OMP18R5相當(dāng)，且ML7、ML8和ML9對(duì)Fzd7的親和力均在皮摩爾范圍內(nèi)(ML7,448±53pM；ML8,4.98±0.28nM；ML9,292±66pM；OMP18R5,236±50pM)。為了檢測(cè)候選克隆是否能結(jié)合到內(nèi)源性的人Fzd7細(xì)胞，我們以Fzd7的CRISPRKO的HEK293T細(xì)胞系作為陰性細(xì)胞對(duì)照。對(duì)一組Fzd7低表達(dá)的人細(xì)胞系進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)。

4. 候選抗體的驗(yàn)證

試驗(yàn)為了評(píng)估ML7對(duì)候選蛋白的特異性，使用了所有Frizzled蛋白(不包括Fzd3)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，ML7對(duì)Fzd1/2/7均有親和力，但對(duì)Fzd5/8的親和力很低。表明ML7具有特異的結(jié)合能力。為了進(jìn)一步比較結(jié)合物，我們使用流式細(xì)胞儀阻斷試驗(yàn)進(jìn)行了初步的表位結(jié)合分析。結(jié)果顯示所有組合均有阻斷作用，但當(dāng)OMP18R5為阻斷劑時(shí)，效果差。這些結(jié)合情況的差異可能具有臨床相關(guān)性，因?yàn)镺MP18R5的臨床試驗(yàn)由于骨相關(guān)不良事件而停止，而Fzd8是已知的骨重塑調(diào)節(jié)因子。結(jié)果顯示，ML7對(duì)Fzd7具有更高水平的特異性，這可能有利于臨床開發(fā)應(yīng)用。