應(yīng)用酵母展示技術(shù)篩選阻斷（blocking）活性抗體

簡(jiǎn)介

酵母展示技術(shù)是基于將目的蛋白展示于酵母細(xì)胞表面的通用技術(shù)，廣泛應(yīng)用于許多生物領(lǐng)域。在抗體文庫(kù)篩選技術(shù)中，我們可以將具有阻斷（blocking）活性的細(xì)胞標(biāo)記上獨(dú)特的熒光信號(hào)，利用流式細(xì)胞分選儀快速準(zhǔn)確地將具有blocking活性的目的細(xì)胞分選出來(lái)。此技術(shù)經(jīng)我們的不斷優(yōu)化，已經(jīng)幫助多位客戶成功篩選到PD-L1、PD-1、TIGIT、CTLA-4等多種靶蛋白分子的阻斷抗體。本文就以靶點(diǎn)PD-L1為例，帶大家了解如何應(yīng)用酵母展示技術(shù)方便、高效地篩選到具有阻斷活性的羊駝單域抗體。

? 靶點(diǎn)背景

程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)是一種免疫檢查點(diǎn)抑制劑，在免疫效應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)。它主要由細(xì)胞表達(dá)的PD-L1激活。PD-1/PD-L1通路在維持外周T淋巴細(xì)胞耐受和調(diào)節(jié)炎癥方面發(fā)揮著微妙的作用。在癌癥中，PD-L1的表達(dá)是主要的免疫逃逸機(jī)制之一。此類免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如抗CTLA-4和抗PD-1/抗PD-L1）的目標(biāo)是通過(guò)阻斷負(fù)通路來(lái)“釋放剎車”并增強(qiáng)T細(xì)胞活化，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的抵抗。[1,2,3]

篩選目標(biāo)：抗體結(jié)合human PD-L1和cyno PD-L1，且阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合

免疫：蛋白human PD-L1免疫羊駝 文庫(kù)構(gòu)建：取羊駝外周血分離PBMC細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，制備VHH文庫(kù)片段，文庫(kù)片段與酵母線性化質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。制備獲得免疫文庫(kù)，庫(kù)容達(dá)到5×108，經(jīng)鑒定文庫(kù)插入率及多樣性良好。

文庫(kù)篩選策略：

原始文庫(kù)首先通過(guò)磁珠篩選，富集識(shí)別PD-L1的陽(yáng)性克隆。再利用流式分選技術(shù)，富集具有阻斷活性的陽(yáng)性克隆。將富集到的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序及單克隆流式鑒定，確認(rèn)具有human PD-L1和cyno PD-L1的結(jié)合活性，并具有PD-1的阻斷活性。

磁珠篩選（MACS）方法：

首先，前一日培養(yǎng)并誘導(dǎo)酵母展示文庫(kù)。篩選當(dāng)天，先將親和素磁珠與生物素化蛋白PD-L1進(jìn)行混合孵育，再將孵育洗滌后的磁珠投入到洗滌后的酵母表達(dá)文庫(kù)中混合孵育1h，然后用磁力架將磁珠酵母復(fù)合物吸附下來(lái)，利用磁力架將復(fù)合物洗滌3次后加入培養(yǎng)液過(guò)夜培養(yǎng)，利用磁力架吸附培養(yǎng)液中的磁珠并棄去。所得酵母菌懸液經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后流式儀鑒定富集效果。

流式細(xì)胞儀分選(FACS)方法：

首先，前一日誘導(dǎo)表達(dá)磁珠篩選得到的酵母文庫(kù)。篩選當(dāng)天，先將生物素化蛋白PD-L1和PD-1分別與過(guò)量的熒光標(biāo)記蛋白SA-650和SA-PE孵育1h，得到PD-L1-650與PD-1-PE，再將洗滌后的文庫(kù)細(xì)胞與PD-L1-650以及表達(dá)標(biāo)簽HA抗體（mouse-anti-HA）混勻孵育1h，然后洗滌孵育細(xì)胞與PD-1-PE以及表達(dá)標(biāo)簽抗體的熒光二抗（Anti-mouse-488）混勻孵育1h，洗滌細(xì)胞上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選操作，標(biāo)記出正常表達(dá)（存在較高熒光信號(hào)488）單細(xì)胞群中具有PD-L1結(jié)合信號(hào)（存在較高熒光信號(hào)650）且不具有PD-1結(jié)合信號(hào)（不存在熒光信號(hào)PE）的細(xì)胞群，分選得到10萬(wàn)細(xì)胞

單克隆流式鑒定方法：

取部分剛分選的細(xì)胞鋪平板，同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)后再次用流式儀進(jìn)行鑒定。如果產(chǎn)物鑒定結(jié)果顯示滿足條件的陽(yáng)性率較高，則挑取數(shù)百單克隆進(jìn)行Sanger法測(cè)序，得到的獨(dú)特克隆再次用流式儀進(jìn)行單克隆鑒定，確認(rèn)單克隆的結(jié)合和阻斷活性。如果產(chǎn)物鑒定結(jié)果顯示滿足條件的陽(yáng)性率不夠高可調(diào)整分選條件重新進(jìn)行本輪流式分選或進(jìn)行下一輪流式分選。

文庫(kù)篩選過(guò)程及結(jié)果：

文庫(kù)第一輪篩選磁珠富集后的產(chǎn)物經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，上流式儀結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，結(jié)合human PD-L1陽(yáng)性率約為11-12%，在表達(dá)細(xì)胞中，同時(shí)具有human PD-L1和human PD-1信號(hào)的細(xì)胞占比約14.28%，只具有human PD-L1信號(hào)的細(xì)胞占比約4.7%，分選只具有human PD-L1信號(hào)的細(xì)胞10萬(wàn)個(gè)。

（第1排為未染色的一輪產(chǎn)物，第2排為染50nM human PD-L1-647和表達(dá)標(biāo)簽HA-488的一輪產(chǎn)物，第3排為染50nM human PD-L1-647、100nM human PD-1-PE和表達(dá)標(biāo)簽HA-488的一輪產(chǎn)物，其中第一列顯示表達(dá)標(biāo)簽-488與human PD-L1-647的信號(hào)，第二列顯示表達(dá)細(xì)胞中human PD-L1-647與human PD-1-PE的信號(hào)，分選得到第3排第2列中D-Q4門中10萬(wàn)細(xì)胞）

分選產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增表達(dá)后，上流式儀鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，分選產(chǎn)物中結(jié)合human PD-L1細(xì)胞占比約66.47%，正常表達(dá)細(xì)胞中具有阻斷活性的細(xì)胞占比96.9%，結(jié)合cyno PD-L1細(xì)胞占比約65.36%。產(chǎn)物human PD-L1陽(yáng)性率高，交叉識(shí)別cyno PD-L1陽(yáng)性率高，且具有阻斷活性的克隆占比很高。

（第1排為未染色的二輪產(chǎn)物，第2排為染50nM human PD-L1-647、100nM human PD-1-PE和表達(dá)標(biāo)簽HA-488的二輪產(chǎn)物，第3排為染50nM cyno PD-L1-647和表達(dá)標(biāo)簽HA-488的二輪產(chǎn)物）

單克隆流式鑒定結(jié)果：

選取獨(dú)特單克隆培養(yǎng)表達(dá)后進(jìn)行流式鑒定（圖4），分別進(jìn)行h-PD-L1和h-PD-1雙染鑒定，和cyno PD-L1單染鑒定。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：h-PD-L1信號(hào)陽(yáng)性，且無(wú)h-PD-1信號(hào)。如果要求cyno交叉，還需cyno-PD-L1信號(hào)陽(yáng)性。

由圖4可判斷，除第6列無(wú)阻斷活性的對(duì)照菌株具有PD-1-PE信號(hào)外，其余鑒定菌株均無(wú)PD-1-PE信號(hào)，鑒定為具有阻斷活性。

（1至5列各列為挑取的獨(dú)特單克隆菌株，第6列為無(wú)阻斷活性的陰性對(duì)照菌株。第1排為h-PD-L1結(jié)合鑒定，橫軸為表達(dá)標(biāo)簽HA-488信號(hào)，縱軸為h-PD-L1-650信號(hào)；第2排為h-PD-L1/h-PD-1阻斷鑒定，橫軸為h-PD-L1-650結(jié)合信號(hào)，縱軸為h-PD-1-PE結(jié)合信號(hào)；第3排為cyno-PD-L1結(jié)合鑒定，橫軸為表達(dá)標(biāo)簽HA-488信號(hào)，縱軸為PD-L1-650信號(hào)）

? 小 結(jié)

本次篩選過(guò)程中，經(jīng)過(guò)一次磁珠富集和一次流式細(xì)胞儀分選，快速得到具有阻斷作用的單域抗體序列。在酵母文庫(kù)篩選過(guò)程中，利用流式細(xì)胞分選儀的優(yōu)勢(shì)，可以在篩選過(guò)程中方便、直觀地將具有阻斷作用的克隆直接分選出來(lái)，提高單克隆鑒定的陽(yáng)性率，快速獲得陽(yáng)性序列。

阿帕克生物利用酵母展示技術(shù)已為多家企業(yè)成功篩選到類似靶分子（例如，PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT等）的阻斷抗體。