驗(yàn)孕試紙改造一下就可以檢測新冠病毒，便攜、成本低、無需儀器！
文章來源：賢集網(wǎng)發(fā)布日期：2022-02-17瀏覽次數(shù)：2541 正值春運(yùn)返鄉(xiāng)大潮，核酸檢測成了熱詞，沒有被捅過鼻子或喉嚨的人生是不完整的。在過去的一年里，陰性核酸檢測報(bào)告在普通人的工作、生活里頻頻亮相，在很多時(shí)候成為返鄉(xiāng)、出差、看病、出行等必不可少的通行證。在疫情防控的背景下，核酸檢測是我們確定是否感染新冠病毒有效的手段。我們所說的核酸檢測是基于RT-PCR技術(shù)檢測SARSCOV-2(新冠病毒)的方法，準(zhǔn)確率非常高，但需要復(fù)雜的儀器和熟練的技術(shù)人員，且耗時(shí)較長。疫情突發(fā)時(shí)，醫(yī)護(hù)人員經(jīng)常徹夜不眠采集樣本，就是為了以快的時(shí)間準(zhǔn)確、高效地鎖定病毒感染者。現(xiàn)場即時(shí)檢測（point-of-care testing，POCT）是在采樣現(xiàn)場進(jìn)行的、利用便攜式設(shè)備及配套試劑快速得到檢測結(jié)果的新方法，具有便攜、成本低、上樣量少等優(yōu)點(diǎn)，對于傳染病和人類疾病的快速診斷尤為重要。驗(yàn)孕試紙(pregnancy test strip,PTS)是一種側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l，通過檢測尿液中hCG（人絨毛膜促性腺激素）的濃度，來判斷婦女是否懷孕。驗(yàn)孕試紙工作原理示意圖可以通過重新設(shè)計(jì)驗(yàn)孕試紙(PTS)以達(dá)到檢測其他物質(zhì)的目的，比如DNA和RNA，其核心在與將目標(biāo)物的存在轉(zhuǎn)化為hCG的產(chǎn)生，目前已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，但也存在著諸如信號穩(wěn)定性和操作靈活性差、檢測靈敏度低、檢測目標(biāo)局限性大等問題。中科院長春應(yīng)化所李冰凌研究員、杜衍研究員及其團(tuán)隊(duì)提出了一種基于CLIPON的方法，集成了核酸-hCG聯(lián)合探針(NHP)、CRISPR-Cas12a、CRISPR RNA（crRNA）和大尺寸DNA組裝體（CLD）等四大要素，為上述問題提供了全面的解決方案，并應(yīng)用于檢測人乳頭瘤病毒(HPV)DNA、SARS-CoV-2冠狀病毒基因組RNA和腺苷（非核酸目標(biāo)物）等。研究內(nèi)容以CLIPON:A CRISPR-Enabled Strategy that Turns Commercial Pregnancy Test Strips into General Point-of-Need Test Devices為題發(fā)表在《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》【技術(shù)路線和檢測原理】圖1.CLIPON：以雙鏈DNA作為檢測目標(biāo)物的檢測原理圖示crRNA與部分DNA靶標(biāo)互補(bǔ)使得crRNA/CRISPR-Cas12a復(fù)合物能夠特異性識別感興趣的靶標(biāo)；crRNA/CRISPR-Cas12a復(fù)合物與DNA靶標(biāo)的結(jié)合會激活Cas12a的非特異性DNA切割活性。激活的Cas12a隨后切割NHP的DNA tag；后，經(jīng)過設(shè)計(jì)的大尺寸DNA組裝體能夠與NHP內(nèi)的DNA tag結(jié)合，從而阻止NHP在PTS上遷移；通過靶向誘導(dǎo)切割去除DNA tag后，NHP的hCG成分就不能與CLD結(jié)合，因此NHP可以在層析試紙上遷移，從而產(chǎn)生信號；因而，當(dāng)含有DNA目標(biāo)物時(shí)，PTS上同時(shí)出現(xiàn)一條檢測線和一條對照線，而當(dāng)不含DNA目標(biāo)物時(shí)，則只出現(xiàn)一條對照線，這就實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)信號的檢測?；贑LIPON的策略有兩大優(yōu)勢:首先,使用CRISPR-Cas12a介導(dǎo)的DNA識別來激活CRISPR的反式DNA切割活性，提供了更高的識別特異性和酶促轉(zhuǎn)換來放大識別事件。其次，以往的方法只能直接檢測ss核酸靶點(diǎn)，而CLIPON可以檢測ss（單鏈）和ds（雙鏈）兩種形式的核酸，因此可用于大部分生物DNA的檢測。第三，NHP中的DNA tag完全獨(dú)立于待檢測目標(biāo)，單個(gè)NHP可用于檢測任何感興趣的目標(biāo)。第四，CLD直接由環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)制備，這是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、廣泛使用的核酸擴(kuò)增技術(shù)。【CLIPON的檢測效果】圖2.使用雙鏈DNA tag目標(biāo)物驗(yàn)證CLIPON文中通過瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)了CLD對NHP的捕獲能力。將CLD與NHP混合確實(shí)阻止了NHP在PTS上的遷移（圖2b），與單獨(dú)使用NHP時(shí)的強(qiáng)測試線相比，CLD和NHP混合后測試線消失。此外，NHP和CLD都可以冷凍干燥長期儲存，凍干后的材料與新制備的材料表現(xiàn)出類似的性能。檢測不含目標(biāo)物的樣本時(shí)不出現(xiàn)測試線，目標(biāo)物dsDNA-T1濃度為50 pM出現(xiàn)可見測試線，這說明在不進(jìn)行信號放大的情況下，CLIPON可以實(shí)現(xiàn)50 pM的檢測限（LOD）。而隨著dsDNA-T1的濃度逐漸增加，測試線的顏色也增強(qiáng)。研究人員還開發(fā)了一款名為“CLIPON image indicator”的手機(jī)app，用于量化PTS的顏色強(qiáng)度。還設(shè)計(jì)了一款手持式微流控芯片，以進(jìn)一步簡化現(xiàn)場測試。結(jié)合高效的重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）反應(yīng)可以進(jìn)一步提高檢出限，RPA-CLIPON的工作機(jī)制如圖3a所示。圖3.RPA-CLIPON：將CLIPON與重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）偶聯(lián)，以高靈敏度檢測DNA基因組研究人員接著對HPV患者的分泌物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，RPA-CLIPON能夠從臨床樣本中檢測HPV-16。針對SARS-CoV-2 RNA基因組的檢測表明，所設(shè)計(jì)的RPA-CLIPON-SARS-CoV-2體系能夠在低水平（20 copies/μL）下特異性地檢測dsDNA-SARS-CoV-2。由于很難獲得真實(shí)的SARS-CoV-2樣本，實(shí)驗(yàn)選擇了具有相同病毒結(jié)構(gòu)但無傳染性的假病毒，結(jié)果表明RPA-CLIPON能夠檢測1000copy/mL(相當(dāng)于1.6aM)的RNA-SARS-CoV-2，靈敏度能夠滿足2019冠狀病毒的臨床檢測需求。RPA-CLIPON也可用于檢測非核酸目標(biāo)物（50μM的腺苷），隨著腺苷濃度的增加，測試線越來越強(qiáng)。圖4.RPA-CLIPON檢測RNA-SARS-CoV-2(與新冠相同的病毒結(jié)構(gòu)但無傳染性)【結(jié)論】文中合理設(shè)計(jì)整合了含驗(yàn)孕試紙(PTS)、CRISPR-Cas12a、大尺寸DNA組裝物的CLIPON生物傳感平臺，提供了快速檢測的新途徑，可對DNA、RNA和非核酸目標(biāo)進(jìn)行檢測。還搭配了手機(jī)App和便攜式微流控芯片，使得CLIPON測試平臺高度自動化，方便快捷。能夠檢測HPV DNA和SARS-CoV-2 RNA，檢出限低至~aM LOD，單次檢測成本3-7美元。目前還需要對上游樣品和處理過程進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)真正的便攜式，滿足現(xiàn)場即時(shí)檢測（POCT）的需求。 
