【關鍵詞】 丙氨酸氨基轉移酶;無償獻血;微板賴氏法
丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的測定,是對無償獻血者及大量體檢時不可缺少的項目之一。目前大多還是采用賴氏試管法來測定,筆者利用酶標儀點對點數據處理系統來建立標準曲線,用微板賴氏法進行測定,既省工、省試劑,也利于原始數據的歸檔管理,現介紹如下。
1 材料與方法
1.1 儀器 MK2型酶標儀;微量加樣器;1011型半自動生化分析儀;96孔平底微孔板、電熱恒溫水溫箱、定時針。
1.2 試劑 ALT賴氏法試劑(上海榮盛生物試劑廠)。ALT定值血清:x=31.5(購自北京九強公司)。
1.3 方法
1.3.1 建立標準曲線 按下表加樣,每管平行做3份。各加入2,4二硝基苯肼液50 μl充分混勻,在電熱恒溫水溫箱中37℃溫育20 min后,各管加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl,充分混勻,靜置10 min,在酶標儀上選擇基礎酶聯模式,測量模式以測定波長492 nm,參考波長630 nm,以“0”號管為空白管,計算方式利用點對點(Point to Point)數據處理程序來建立標準曲線并用(SAVE)鍵保存,依次輸入酶活力單位值,平行份數及位置,然后確定,按“Start”鍵測定,系統自動根據不同酶活力單位與對應的平均A值建立標準曲線。經過分析認為曲線良好,然后按“SAVE”鍵,選擇一個序號將其保存。注意下次建立標準曲線時,可以按上述步驟建立,也可以直接利用“SAVE”鍵調出原來的標準曲線序號,按“Start”選擇建立新標準曲線模式來自動建立。
1.3.2 標本測定 在微板上設A1為空白孔,加10 μl磷酸鹽緩沖液,50 μl基質液;測定孔加標本10 μl,然后分別加入50 μl基質液,充分混勻,然后再在37℃溫育30 min后每孔加入2,4二硝基苯肼50 μl,混勻,37℃溫育20 min,每孔加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl,充分混勻室溫靜置10 min后,在酶標儀基礎酶聯模式下按“SAVE”鍵選擇序號,調出保存的標準曲線,按“Start”選擇“利用舊標準曲線測量模式”直接進行測定,結果ALT酶活力單位直接被打印出來。
1.3.3 微板賴氏法點對點測定的準確性估計 從本中心血庫無償獻血者標本中隨機抽取20份標本,分析用微板賴氏法酶標儀點對點和試管賴氏法來測定ALT,將結果做配對資料t檢驗,借以估計二者是否存在顯著差異,間接評估其準確性。
表1 點對點測定的準確性估計(略)
1.3.4 微板賴氏法酶標儀點對點測定ALT的精密度估計 在每天日常檢驗工作中,每天加檢一份ALT定值質控血清樣品,采用微板賴氏法酶標儀點對點法和試管賴氏法測定ALT,連續(xù)20次,計算其標準差與變異系數,判斷其精密度。
1.3.5 微板賴氏法酶標儀點對點測定ALT重復性估計 從微板賴氏法酶標儀測定的無償獻血者1 390人中,隨機抽取25份標本,重復測定,2次結果做配對差值統計分析,判斷其重復性。