微板賴氏法酶標儀點對點定量測定丙氨酸氨基轉移酶活力

【關鍵詞】 丙氨酸氨基轉移酶；無償獻血；微板賴氏法

　　丙氨酸氨基轉移酶（ALT）的測定，是對無償獻血者及大量體檢時不可缺少的項目之一。目前大多還是采用賴氏試管法來測定，筆者利用酶標儀點對點數據處理系統來建立標準曲線，用微板賴氏法進行測定，既省工、省試劑，也利于原始數據的歸檔管理，現介紹如下。

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器 MK2型酶標儀；微量加樣器；1011型半自動生化分析儀；96孔平底微孔板、電熱恒溫水溫箱、定時針。

　　1.2 試劑 ALT賴氏法試劑（上海榮盛生物試劑廠）。ALT定值血清：x=31.5（購自北京九強公司）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 建立標準曲線 按下表加樣，每管平行做3份。各加入2,4二硝基苯肼液50 μl充分混勻，在電熱恒溫水溫箱中37℃溫育20 min后，各管加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl，充分混勻，靜置10 min，在酶標儀上選擇基礎酶聯模式，測量模式以測定波長492 nm，參考波長630 nm，以“0”號管為空白管，計算方式利用點對點（Point to Point）數據處理程序來建立標準曲線并用（SAVE）鍵保存，依次輸入酶活力單位值，平行份數及位置，然后確定，按“Start”鍵測定，系統自動根據不同酶活力單位與對應的平均A值建立標準曲線。經過分析認為曲線良好，然后按“SAVE”鍵，選擇一個序號將其保存。注意下次建立標準曲線時，可以按上述步驟建立，也可以直接利用“SAVE”鍵調出原來的標準曲線序號，按“Start”選擇建立新標準曲線模式來自動建立。

　　1.3.2 標本測定 在微板上設A1為空白孔，加10 μl磷酸鹽緩沖液，50 μl基質液；測定孔加標本10 μl，然后分別加入50 μl基質液，充分混勻，然后再在37℃溫育30 min后每孔加入2,4二硝基苯肼50 μl，混勻，37℃溫育20 min，每孔加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl，充分混勻室溫靜置10 min后，在酶標儀基礎酶聯模式下按“SAVE”鍵選擇序號，調出保存的標準曲線，按“Start”選擇“利用舊標準曲線測量模式”直接進行測定，結果ALT酶活力單位直接被打印出來。

　　1.3.3 微板賴氏法點對點測定的準確性估計 從本中心血庫無償獻血者標本中隨機抽取20份標本，分析用微板賴氏法酶標儀點對點和試管賴氏法來測定ALT，將結果做配對資料t檢驗，借以估計二者是否存在顯著差異，間接評估其準確性。

　　表1 點對點測定的準確性估計（略）

　　1.3.4 微板賴氏法酶標儀點對點測定ALT的精密度估計 在每天日常檢驗工作中，每天加檢一份ALT定值質控血清樣品，采用微板賴氏法酶標儀點對點法和試管賴氏法測定ALT，連續(xù)20次，計算其標準差與變異系數，判斷其精密度。

　　1.3.5 微板賴氏法酶標儀點對點測定ALT重復性估計 從微板賴氏法酶標儀測定的無償獻血者1 390人中，隨機抽取25份標本，重復測定，2次結果做配對差值統計分析，判斷其重復性。