研究小組用高通量測序技術(shù)確定RNA結(jié)構(gòu)

 利用深度測序進行全基因組RNA結(jié)構(gòu)檢測 通過圖示概述了Kertesz(左)和Underwood(右)所用的方法。注意在Underwood的研究中，孵育對照(有或無激酶處理組)是平行完成的。

　　模平行測序技術(shù)使得研究人員能夠?qū)蚪M進行快速的深度測序，從而從根本上改變了基因組學(xué)的發(fā)展。在本期的《自然-方法學(xué)》(Nature Methods)和《自然》(Nature)雜志兩篇新的論文中Underwood和Kertesz兩個研究小組利用高通量測序技術(shù)確定了所有RNA轉(zhuǎn)錄物的二級結(jié)構(gòu)。

　　在過去的一些研究中全基因組測序技術(shù)被應(yīng)用于確定細胞結(jié)構(gòu)與DNA區(qū)域或mRNAs之間形成的復(fù)合物的特征。雖然這些研究提供了關(guān)于調(diào)控復(fù)合物組成的信息，然而研究人員卻無法解析這些RNAs的結(jié)構(gòu)

　　近的研究證實RNAs在調(diào)控基因表達和基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮了多重功能，這一課題日益引起了研究界的廣泛關(guān)注。在這些調(diào)控過程中，RNA的結(jié)構(gòu)是一個關(guān)鍵的影響因素——決定了是直接監(jiān)控外部或內(nèi)部信號，或是為反式作用因子提供特異的結(jié)合位點。

　　RNA轉(zhuǎn)錄物是一種單鏈分子，當(dāng)其發(fā)生自身折疊并形成Watson-Crick堿基對，可生成各種長度和不同復(fù)雜性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)是RNA中普通的二級結(jié)構(gòu)形式，其進一步組裝則形成了復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。了解RNA二級結(jié)構(gòu)是研究人員揭示RNA活性，發(fā)現(xiàn)伴侶蛋白結(jié)合印跡及突變影響關(guān)鍵性的步。

　　對于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的RNAs，檢測其二級結(jié)構(gòu)高效和安全的方法就是對同源序列進行種系發(fā)生比較?？茖W(xué)家們認為同源序列可生成相似的折疊，從而維持了相同的核心螺旋數(shù)目和長度。在保守的Watson-Crick堿基對區(qū)域，Watson-Crick堿基對改變通常是兩個核苷酸遵循Watson-Crick堿基配對而同時發(fā)生變化。然而在種系發(fā)生過程中由于序列具有高度保守性此時該機制不發(fā)生作用，從而不顯示核苷酸協(xié)同變異。

　　當(dāng)RNA具有超過一個穩(wěn)定折疊的結(jié)構(gòu)時，種系發(fā)生比較是非常困難的。在這種情況下，研究人員只能借助電腦模擬的方法，基于實驗獲得堿基對能量集合通過大化堿基對數(shù)目計算出小的二級結(jié)構(gòu)自由能。

　　在試驗中研究人員可通過化學(xué)檢測或酶檢測的方法解決這些問題。這些試驗可在缺乏或存在蛋白質(zhì)或其他配體以及各種溫度或條件下在體外或體內(nèi)完成。無論是化學(xué)檢測還是酶檢測，RNA的可接近性都是反應(yīng)的重要標(biāo)準(zhǔn)。在化學(xué)檢測中，一個成分確定的化合物可通過與RNA堿基上某個精密位點或糖磷骨架發(fā)生反應(yīng)，從而對RNA起作用。

　　在酶檢測中，則是用一種RNA切割酶與RNA的非配對或配對區(qū)域發(fā)生反應(yīng)。通過這種檢測方法(通常在引物延伸后用凝膠電泳方法檢測片段)顯示出在結(jié)構(gòu)上與化合物或酶易于接近的堿基?；衔餀z測生成的是原子水平的信息，而酶檢測主要生成螺旋和非螺旋區(qū)域的信息。這些實驗方法通常工作量大，在各種操作過程中需要多種專業(yè)知識。這樣的數(shù)據(jù)可局限性地應(yīng)用于計算機折疊程序中，利用序列預(yù)測RNA的二級結(jié)構(gòu)。

　　Underwood和Kertesz利用了高通量深度測序策略獲得了從細胞中抽提的RNA轉(zhuǎn)錄物復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)信息(圖1)。在兩篇論文中，研究人員分別獲得了來自酵母或小鼠細胞的RNAs，在確定的實驗條件下按照選擇的尺寸對其進行酶水解。酶水解的RNA產(chǎn)生了5′-磷酸基，利用接頭選擇性連接切割的片段而非帶有5′-OH片段的水解降解產(chǎn)物。在反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增后，對生成的文庫進行深度測序。

　　這兩篇論文使用的方法不同之處在于所使用的酶以及數(shù)據(jù)處理的方式。Kertesz等利用了兩種酶：RNase V1，可特異識別RNA雙鏈區(qū)域;S1單鏈核酸酶(nuclease S1),可特異性識別RNA單鏈區(qū)域。后的得分是RNase V1和nuclease S1從分析殘基后的核苷酸開始切割形成的片段讀數(shù)的log值。Underwood等利用了一個特異識別RNA單鏈區(qū)域的P1單鏈核酸酶(nuclease P1)，并設(shè)立了兩個對照，其中一個未經(jīng)核酸酶處理以估計內(nèi)源切割保留的5′磷酸鹽的量，另一個則加入了T4連接酶檢測未保留5′磷酸鹽的切割。后得分是核酸酶組與對照組計數(shù)值的log值。

　　酶檢測的一個重要條件是每個RNA分子僅能切割一次，因為二次切割將無法反映其天然狀態(tài)。所有類型的RNA分子切割條件很少相同，并且不能確定單擊動力學(xué)是否完成。Kertesz等，過假定堿處理導(dǎo)致了5′-OH片段，且這種5′-OH片段可避開深度測序分析而對非特異性切割進行間接控制。Underwood等在分析中就間接考慮了控制，因此數(shù)據(jù)在更堅實的基礎(chǔ)上(圖1)。

　　Underwood等采用的方法具有的明顯優(yōu)勢，作者提供了一個軟件可將圖形序列讀值轉(zhuǎn)化為一種可被加州大學(xué)圣克魯斯分校(UCSC)基因組瀏覽程序識別的格式序列，也可通過輸入到一種RNA預(yù)測軟件中得到與實驗數(shù)據(jù)和能量小化計算結(jié)果相容的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果。

　　將S1或P1單鏈核苷酸與RNase V1結(jié)合使用提供了互補的信息，并對RNA結(jié)構(gòu)分析添加了限制。這些酶探針通常對空間位阻敏感，因此不會生成RNA結(jié)構(gòu)的原子信息。在未來研究人員有可能利用化學(xué)探針提供更詳細的信息，并使其在體內(nèi)容易使用

　　雖然這兩種方法都有著相同的缺點即由于需從細胞中抽提RNAs并在緩沖液中復(fù)性從而有可能生成體外結(jié)果，然而它們打開了多個研究方向。其衍生的一個生物體基因組上的RNA結(jié)構(gòu)動力學(xué)完整圖像對應(yīng)著廣泛的環(huán)境條件例如溫度、pH值或其他。利用平行測序，并通過在原核或真核細胞中添加各種調(diào)控因子(RNA結(jié)合蛋白、代謝產(chǎn)物或調(diào)控反式作用RNA)的方法可對全RNA的結(jié)構(gòu)變化進行監(jiān)控。這一實驗還將有助于鑒別靶向調(diào)控因子的整套原始RNA?，F(xiàn)在在活細菌中或在真核細胞無生命或有生命壓力下對對應(yīng)環(huán)境變化的RNA結(jié)構(gòu)動力學(xué)進行完全檢測已經(jīng)成為了可以達成的目標(biāo)。而那樣的一種“RNA結(jié)構(gòu)組”將是在活生物體內(nèi)建立以RNA為基礎(chǔ)的調(diào)控和反應(yīng)性網(wǎng)絡(luò)所必需的。

　　12月份出版的《自然—方法學(xué)》刊登了一篇文章，描述了一種高通量RNA結(jié)構(gòu)測定方法——“片段化測序”法(Fragmentation sequencing ，F(xiàn)ragSeq)。相關(guān)研究由美國加州大學(xué)圣克魯茲分校霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究院教授索菲·薩拉馬(Sofie Salama)所領(lǐng)導(dǎo)的課題組完成。

　　RNA對基因表達和基因組穩(wěn)定性的調(diào)控作用成為近來研究的熱點，而弄清RNA二級結(jié)構(gòu)是理解RNA功能的個必要步驟。測定非編碼RNA結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法是化學(xué)法和酶法，但是它們一次只能測定一個RNA分子，這種方法不僅費力而且對技術(shù)要求高。FragSeq法卻可以在整個轉(zhuǎn)錄組水平同時對大量RNA進行結(jié)構(gòu)測定。

　　該研究利用核酸酶P1將小鼠RNA進行片段化，得到20–100-nt 大小片段;之后在片段的5"-PO4和3"-OH端分別加上接頭，通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增之后，構(gòu)建FragSeq文庫并對其進行深測序。為了保證文庫片段均是由核酸酶P1剪切產(chǎn)生，薩拉馬等設(shè)置了兩個對照組：一組RNA不使用核酸酶P1處理來估算由內(nèi)源降解產(chǎn)生5"-PO4基團的片段數(shù)，另一組則多加了T4連接酶處理RNA，以此來計算不產(chǎn)生5"-PO4基團的片段數(shù)。通過凝膠電泳分離出目標(biāo)片段。后薩拉馬等利用一種軟件，可以將大量測序結(jié)果格式化，使其能夠被一種RNA預(yù)測軟件讀取，進而預(yù)測出RNA二級結(jié)構(gòu)。