流式細(xì)胞術(shù)對食管癌、賁門癌患者T細(xì)胞亞群的分析

【摘要】  目的 采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測食管癌、賁門癌患者細(xì)胞免疫功能。方法 應(yīng)用三色免疫熒光流式細(xì)胞儀測定145名食管癌和賁門癌患者及18例正常對照者外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞、CD4+/CD8+比值。結(jié)合臨床病理結(jié)果探討二者之間的關(guān)系。結(jié)果 (1)食管癌、賁門癌患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞比例較正常對照組明顯升高（P＝0.030）；CD3+、CD4+亞群較正常值降低，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NK細(xì)胞兩組比較也沒有顯著性差異；(2)早期（0、Ⅰ期）食管癌、賁門癌病人和健康對照組之間T細(xì)胞各亞群相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；中、晚期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）食管癌、賁門癌病人和健康對照組相比：CD4+明顯降低（P＝0.023）；CD8+則明顯升高（P＝0.021）；CD4+ /CD8+較正常有所下降，但是沒有顯著性差異；淋巴結(jié)陰性患者和淋巴結(jié)陽性患者比較T細(xì)胞各亞群沒有明顯差異。結(jié)論 外周血T細(xì)胞亞群的檢測有助于提高對食管癌患者的病情，臨床分期以及機(jī)體免疫狀態(tài)的判斷，晚期食管癌患者機(jī)體免疫狀態(tài)成紊亂型改變。

【關(guān)鍵詞】  食管癌 賁門癌 T細(xì)胞亞群 流式細(xì)胞術(shù) 臨床分期

   0  引言

    惡性腫瘤患者往往伴有機(jī)體免疫機(jī)能低下和紊亂，免疫機(jī)能低下和紊亂對腫瘤發(fā)生發(fā)展起到一定的作用。流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞亞群具有快速、多參數(shù)、可定量、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，國外已有較多報(bào)道。食管癌、賁門癌患者的機(jī)體免疫狀態(tài)尤其是細(xì)胞免疫狀態(tài)國內(nèi)已有報(bào)道，但所用研究方法多為傳統(tǒng)的免疫細(xì)胞學(xué)方法。本研究通過三色免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)分析145名食管癌、賁門癌患者外周血T細(xì)胞亞群，并結(jié)合臨床病理分期，分析食管癌、賁門癌患者細(xì)胞免疫狀態(tài)的改變及其臨床意義。

    1  資料和方法

    1.1  資料和方法

    收集2004年6月～2005年8月在我科住院治療的145名食管癌及賁門癌患者，所有病例抽血化驗(yàn)前均未行放、化治療，并均經(jīng)胃鏡活檢證實(shí)診斷。年齡29～85歲，男性105名，女性40名，平均年齡61.03歲。食管癌116例，賁門癌29例。病理類型食管癌鱗癌113例，賁門癌腺癌28例，食管腺鱗癌2例，賁門腺鱗癌1例，食管小細(xì)胞癌1例。其中127名患者經(jīng)手術(shù)治療并有相應(yīng)的術(shù)后病理結(jié)果。18名患者未行手術(shù)治療（轉(zhuǎn)放療科8人，轉(zhuǎn)內(nèi)科5人，其他原因未治出院5人）。以18名健康成年人作為對照組。145名患者和健康對照組于入院進(jìn)行治療之前清晨空腹抽靜脈血2ml,EDTA鉀鹽抗凝。獲得標(biāo)本后立即送檢。

    1.2  腫瘤分期

    腫瘤分期根據(jù)CT、胸片、腹腔B超及手術(shù)后病理結(jié)果采用UICC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中0期原位鱗癌1例；Ⅰ期16例；Ⅱ期59例；Ⅲ期47例；Ⅳ期4例；沒有分期資料18例。

    1.3  試劑和儀器

    試劑：美國Couter公司進(jìn)口試劑，包括CD4－FITC／CD8－PE／CD3－Percp三色標(biāo)記的單克隆抗體。儀器：美國Couter 公司Epics Xl型流式細(xì)胞儀。

    1.4  三色免疫熒光染色

    取CD4－FITC／CD8－PE／CD3－Percp三色標(biāo)記的單克隆抗體20μl加入試管管底，加入待檢驗(yàn)的經(jīng)EDTA鉀鹽抗凝的全血50μl，混勻，避光室溫下染色15min。然后加入OptilyseC 溶血素500μl，充分混合后立即上機(jī)檢測。

    1.5  流式細(xì)胞儀分析

    使用Couter 公司配套的System Ⅱ系統(tǒng)軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。先進(jìn)行光路流路的較準(zhǔn)，較準(zhǔn)后進(jìn)行熒光補(bǔ)償，然后上樣本檢測。

    1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS10.0處理試驗(yàn)結(jié)果，兩組之間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的雙側(cè)t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

    2  結(jié)果

    2.1  T細(xì)胞亞群

    CD3+、CD4+亞群較正常值降低，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NK細(xì)胞兩組比較也沒有顯著性差異，表1。表1  食管、賁門癌患者和正常對照組T細(xì)胞亞群比較食管癌、賁門癌患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞比例較正常對照組明顯升高（P<0.05）

    2.2  T細(xì)胞亞群和臨床病理分期的關(guān)系

    2.2.1  早期病人和健康對照組T細(xì)胞亞群比較  早期食管癌、賁門癌病人和健康對照組之間T細(xì)胞各亞群相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。表2  早期患者和健康對照組T細(xì)胞亞群比較

    2.2.2  中、晚期食管癌、賁門癌病人和健康對照組T細(xì)胞亞群比較  CD4+ /8CD+較正常有所下降，但是沒有顯著性差異，見表3。表3  中、晚期患者和健康對照組T細(xì)胞亞群比較中、晚期食管癌、賁門癌病人和健康對照組相比：CD4+明顯降低；CD8+則明顯升高（P<0.05）

    2.2.3  淋巴結(jié)陰性病人和淋巴結(jié)陽性病人T細(xì)胞亞群比較  淋巴結(jié)陰性患者和淋巴結(jié)陽性患者各T細(xì)胞亞群比較無顯著性差異。表4  淋巴結(jié)陰性組和淋巴結(jié)陽性組比較注：6例探查病人按淋巴結(jié)陽性處理

    3  討論

    機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)以細(xì)胞免疫為主,T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中起重要作用。根據(jù)T細(xì)胞表面分化抗原的不同，T細(xì)胞主要可以分為兩大類：CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞。CD4+主要是輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）, CD8+包括細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）和抑制性T淋巴細(xì)胞（TS）。CD4+T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤細(xì)胞免疫中發(fā)揮核心的作用。通過抗CD4+抗體或者CD4+基因敲除動(dòng)物試驗(yàn)研究顯示：缺乏CD4+T淋巴細(xì)胞的試驗(yàn)動(dòng)物不能產(chǎn)生抗體特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞［1，2］，而且CD4+T細(xì)胞通過分泌的IL2等細(xì)胞因子對于CD8+T淋巴細(xì)胞功能的維持是不可缺少的［3］。顯然，機(jī)體通過CD4+T淋巴細(xì)胞來達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的目的。惡性腫瘤患者CD4+T細(xì)胞亞群的改變情況報(bào)道不一，但多數(shù)研究CD4+T細(xì)胞亞群在惡性腫瘤患者中減少［4，5］。本研究雖然中晚期食管癌患者CD4+T細(xì)胞明顯降低，但在早期，CD4+T細(xì)胞的改變無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。已知淋巴細(xì)胞的數(shù)量不是由淋巴干細(xì)胞生產(chǎn)的多少來決定的，而是通過成熟淋巴細(xì)胞自我穩(wěn)定性的增殖進(jìn)行調(diào)控［6，7］。早期，機(jī)體自穩(wěn)定機(jī)制尚可以發(fā)揮作用，當(dāng)CD4+T細(xì)胞減少時(shí)，即很快出現(xiàn)CD4+T細(xì)胞增殖從而保持相對的穩(wěn)定。由于早期沒有明顯的免疫功能變化，提示腫瘤細(xì)胞能夠逃脫免疫破壞而得以發(fā)生、發(fā)展。本研究顯示：CD8+T細(xì)胞在患者體內(nèi)明顯高于對照組。由于目前國內(nèi)多數(shù)單位開展的T細(xì)胞亞群檢測只是檢測各亞群的比例而不是值，因此，可能存在兩種原因：一是由于CD4+T淋巴細(xì)胞比例減少，相應(yīng)地導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞比例增加；二是CD8+T淋巴細(xì)胞值增加。對于種可能性，進(jìn)一步開展T細(xì)胞亞群數(shù)量的測定可以明確；對于第二種可能，有學(xué)者認(rèn)為CD8+T淋巴細(xì)胞可以根據(jù)功能進(jìn)一步分為抑制性T淋巴細(xì)胞（TS）和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（TC），晚期腫瘤患者存在抑制性T淋巴細(xì)胞（TS）的增加。由于目前區(qū)分TS和TC尚有一定困難，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

    機(jī)體腫瘤免疫是抗腫瘤細(xì)胞免疫和腫瘤免疫抑制、免疫逃避之間的平衡。CD4+T細(xì)胞所占比例的下降必然導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞比例的增加，從而形成CD4+／CD8+比值的下降。Dick等［8］認(rèn)為：CD4+／CD8+的比值可以反映機(jī)體的抗腫瘤免疫狀態(tài)，大致反映上述兩者之間的平衡關(guān)系。晚期腫瘤患者外周血中CD4+／CD8+比值下降，甚至比值倒置，說明患者免疫處于抑制狀態(tài)。本研究顯示：食管癌、賁門癌患者CD4+／CD8+雖然有下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Dick研究對象多為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期患者，本文研究對象均為外科待術(shù)的病人，145名患者中只有4例Ⅳ期病人，這種研究對象構(gòu)成的差異導(dǎo)致了不同的結(jié)果。

    NK細(xì)胞對腫瘤具有非特異性的殺傷作用，被認(rèn)為是機(jī)體抗腫瘤免疫的道防線。不需要致敏即可發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的攻擊作用。近年來研究表明：NK細(xì)胞不僅在非特異性抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，并且具有激活和增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的功能，因此，NK細(xì)胞起到連接非特異性免疫和特異性免疫的作用［9］。但是，由于NK細(xì)胞在細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞中所占比例很小［10］，并且在外周血淋巴細(xì)胞中只占15％［11］，所以目前認(rèn)為其在抗腫瘤的細(xì)胞免疫中的作用沒有T淋巴細(xì)胞突出。本研究顯示：食管癌、賁門癌患者的NK細(xì)胞和健康對照組沒有明顯差異。

【參考文獻(xiàn)】
  ［1］ Hung K, Hayashi R, LafondWalker A, et al. The central role of CD4+ T cells in the antitumor immune response\[J\]. J Exp Med, 1998,188(12):23572368.

［2］ Goedegebuure, P., T. Eberlein. The role of CD4+ tumorinfiltrating lymphocytes in human solid tumors. Immunol\[J\]. Res, 1995,14（2）:119131.

［3］ Rosenberg S A, Yang J C, Schwartzentruber D J, et al. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with me[x]tastatic melanoma\[J\]. Nat Med, 1998,4（3）: 321327.

［4］ Saito T, Shimoda K, Kinoshita, T, et al. Prediction of operative mortality ba[x]sed on impairment of host defense systems in patients with esophageal cancer\[J\]. J Surg Oncol, 1993,52(1):18.

［5］ Mitropoulos D, Alamanis C, Deliveliotis C, et al. Tlymphocyte subsets in the peripheral blood of patients with renal cell carcinoma\[J\]. Acta Urol Belg,1995,63(3):2125.

［6］ Khaled AR, Durum SK. The role of cytokines in lymphocyte homeostasis. Biotechniques, 2002,Suppl: 4045.

［7］ Surh CD, Sprent J. Regulation of naive and memory Tcell homeostasis\[J\]. Microbes Infect, 2002,4(1): 5156.

［8］ Dick H M. Monoclonal antibody in clinical medicine\[J\].Br Med J, 1985,291(6498):762764.

［9］ DegliEsposti MA.& Smyth, M.J. Close encounters of different kinds: dentritic cells and NK cells take center stage\[J\]. Nature Rev Immunol,2005,5(2):112124.

［10］Pross H F, Lotzova E. Role of natural killer cells in cancer\[J\]. Nat Immun, 1993,12(45):279292.

［11］Cooper M A, Fehniger T A, Caligiuri M A. The biology of human natural killercell subsets\[J\]. Trends Immunol, 2001,22(11):633640.

作者：沈玉光

作者單位：450008 鄭州，河南省腫瘤醫(yī)院胸外科