幽門螺桿菌雙亞單位基因疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究

【摘要】  目的：構(gòu)建幽門螺桿菌（Hp）兩個保護(hù)性亞單位UreB、HspA融合基因疫苗并觀察其免疫原性。方法：從Hp基因組分別擴增出UreB、HspA基因片段，采用重疊延伸PCR方法將兩個基因片段構(gòu)建融合基因，以BglⅡ和XhoⅠ酶切位點克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中，經(jīng)測序確認(rèn)后轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，Western blot檢測目的蛋白表達(dá)，脛前肌注射免疫小鼠后收集血清檢測特異性抗體效價。結(jié)果：經(jīng)測序后證實成功將融合基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體中，免疫印記檢測到目的蛋白表達(dá)，并具有良好的抗原性，免疫小鼠后能夠產(chǎn)生特異性抗體。結(jié)論：成功構(gòu)建Hp雙價DNA疫苗，免疫小鼠后顯示出良好的免疫原性，為Hp進(jìn)一步基因疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】  幽門螺桿菌 DNA疫苗 尿素酶 熱休克蛋白

　　AConstruction and immunogenicity studies on a fused DNA vaccine with UreB and HspA of Helicobacter pylori

　　YUAN XiaoPeng, ZOU QuanMing, HONG Yu, BAI Yang, WU Chao, ZHANG WeiJun.

　　Department of Clinical Microbiology and Immunology & Chongqing Engineering Technology Research Center of Biopharmaceuticals,the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　［Abstract］ob[x]jective:To construct a fused H.pylori DNA vaccine consisting of UreB, HpaA gene fragments, and observe its immunogenicity.Methods:The fragment of UreB and HspA genes was obtained by PCR amplification from H.pylori genome DNA, then the fusing gene UH was obtained by SOE PCR(splicing by overlap extension). UH was subcloned into an eukaryotic ex[x]pression vector pcDNA3.1. Then the fusion protein was identified by Western blot after plasmid pcDNA3.1UH was transfected into COS7 cells and ELISA was used to detect the specific antibody after immunization in mice.Results:The eukaryotic ex[x]pression plasmid of the fusing gene two fragments was constructed,and a novel fusion protein was expressed after transfection into COS7 cell. Specific antibody was found in mouse serum after immunization with the DNA vaccine.Conclusion:A fused DNA vaccine of from H.pylori with good immunogenicity has been successfully constructed, which lay a foundation for further investigation on H.pylori DNA vaccine.

    ［Key words］  Helicobacter pylori；DNA vaccine；UreB；HspA
   
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種全世界范圍的人類感染病原菌，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。Hp中富含的尿素酶B（UreB）、熱休克蛋白A（HspA），在Hp疫苗的研究中，在動物保護(hù)實驗中已經(jīng)證實具有一定的免疫保護(hù)效果，兩者共同應(yīng)用具有比單一抗原更好的保護(hù)效果［13］。本實驗室在前期的研究工作中已經(jīng)分別對包括尿素酶B（UreB）、熱休克蛋白A（HspA）、鞭毛粘附素（HpaA）等在內(nèi)的多個Hp的亞單位蛋白進(jìn)行了研究，取得了相應(yīng)的研究結(jié)果。本研究擬采用UreB、HspA兩個亞單位部分片段構(gòu)建融合基因，構(gòu)建雙價基因疫苗，進(jìn)行Hp多亞單位組分基因疫苗的研究。為進(jìn)一步探索基因疫苗存在的保護(hù)性機制以及構(gòu)建Hp多肽疫苗打下基礎(chǔ)。

　　1  材料與方法

　　1.1  細(xì)菌及細(xì)胞

　　幽門螺桿菌ACTC11637、E.coli DH5α、pCDNA3.1（+）和COS7細(xì)胞均由本室保存。

　　1.2  試劑和儀器
 
　　Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、pMD18T載體購自大連Takara公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；rUreB、rHspA重組蛋白、兔抗rUreB、rHspA血清本室制備；羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體購自晶美公司。

　　1.3  DNA雙價疫苗的構(gòu)建

　　采用Primer 5.0軟件設(shè)計相關(guān)的引物，PCR從幽門螺桿菌基因組中分別擴增UreB和HspA基因片段，通過對融合后雙亞單位基因核苷酸以及載體多克隆位點的檢索與選擇，設(shè)計相應(yīng)重疊延伸PCR的引物，在重疊延伸生成的片段的上下游分別引入BglⅡ和XhoⅠ酶切位點，重疊延伸PCR將2個基因構(gòu)建成為一個融合基因插入到T克隆載體上，經(jīng)測序驗證序列正確后，雙酶切將融合基因片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中。

　　1.4  真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及體外表達(dá)

　　采用omga質(zhì)粒大抽試劑盒抽提質(zhì)粒，紫外分光光度計260/280雙波長定量，脂質(zhì)體法常規(guī)方法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，24～48小時后收集培養(yǎng)上清，預(yù)處理后8%SDSPAGE蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移PVDF膜后以5%牛血清白蛋白封閉過夜，分別以兔抗UreB、HpaA抗體為一抗，羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western blot實驗。

　　1.5  小鼠的免疫試驗及特異性抗體的檢測

　　20只小鼠隨機分為2組，分別以空質(zhì)粒和構(gòu)建的真核表達(dá)載體質(zhì)粒DNA與0.75%布比卡因4∶1體積比混合，小鼠左右脛前肌和股四頭肌多點注射，每3周免疫1次，共3次，末次免疫后3周分別收集小鼠血清，抗體稀釋液1∶200倍稀釋待檢血清，100 μl/孔，分別加入已包被Hp UreB、HspA蛋白的ELISA板，37℃ 60分鐘，洗滌液洗滌4次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶20 000)，100 μl/孔，37℃ 30分鐘，洗滌4次，加入OPD底物顯色液，室溫避光反應(yīng)30分鐘，50 μl終止液終止反應(yīng)，以PBS孔作空白對照，492 nm測定各孔OD值。

　　1.6  攻毒保護(hù)實驗

　　20只小鼠，免疫方法同前，分為2組，每組10只小鼠，于末次免疫后10天免疫組與對照組用Hp ATCC11637株菌液進(jìn)行灌喂。所有小鼠提前24小時斷食、斷水，每只灌喂約108 CFU菌液，上、下午各1次，間隔6小時，末次后2小時進(jìn)食水。攻毒后4周小鼠脫頸處死。取出鼠胃，沿胃大彎剖開，用生理鹽水輕輕沖掉胃內(nèi)殘留物，將胃粘膜組織涂布Hp專用培養(yǎng)基，三線法劃線接種，微需氧培養(yǎng)72小時后檢測。

　　2  結(jié)果

　　2.1  DNA雙亞單位載體的構(gòu)建和鑒定

　　PCR自Hp基因組中分別擴增出UreB和HspA片段，見圖1A中4、5條帶；采用重疊延伸PCR的方法以第1次擴增的UreB和HspA片段基因為模板，2次擴增得到HspAUreB融合基因hu片段，見圖1A中2、3條帶。

　　2.2  真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

　　由序列檢索得知，目的融合基因與真核表達(dá)載體上各存在一個HindⅢ酶切位點，構(gòu)建成功的表達(dá)載體pcDNA3.1(+)hu的重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切呈現(xiàn)三條帶，小片段分別約為300、800 bp，大片段與空載體單酶切相同大小約為5 000 bp，與預(yù)計相符，證明構(gòu)建成功，見圖1B。

　　2.3  融合基因在細(xì)胞中的表達(dá)

　　兔抗Hp血清Western blot結(jié)果顯示在20 000附近出現(xiàn)一明顯褐色沉淀，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相應(yīng)部位沒有條帶產(chǎn)生，見圖2。

　　2.4  小鼠血清特異性IgG檢測結(jié)果

　　末次免疫后1個月，分別以UreB、HspA蛋白通過ELISA的方法檢測，pcDNA3.1hu免疫組血清中的特異性IgG比空質(zhì)粒免疫組增高，差異顯著，見表1、圖3。表1  免疫后BALB/c小鼠血清抗Hp特異抗體反應(yīng)情況（略）

　　2.5  攻毒保護(hù)試驗的結(jié)果

　　免疫后10天動物保護(hù)試驗各組結(jié)果見表2，可以看到pcDNA3.1(+)hh質(zhì)粒免疫組與空質(zhì)粒組保護(hù)率相比差異顯著(P<0.001)。表2  各實驗組小鼠免疫后Hp攻毒情況（略）

　　3  討論

    幽門螺桿菌是一種全世界范圍的人類感染病原菌，感染率占世界人口的一半以上。自1982年Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)Hp以來，人們經(jīng)研究確認(rèn)其與B型(胃竇)胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌等多種疾病相關(guān)，1998年世界衛(wèi)生組織將其列為一類致癌因子。對Hp的免疫發(fā)病機制和免疫接種誘發(fā)的保護(hù)性機制的逐步了解，使人們認(rèn)清通過疫苗刺激機體產(chǎn)生不同于自然感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)，可以預(yù)防和治療Hp感染。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對其展開了一系列的研究，大多數(shù)研究都是針對單亞單位和蛋白質(zhì)疫苗為主的疫苗研究?；蛞呙缬少|(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，能按其天然構(gòu)象進(jìn)行折疊，從而有利于中和抗體的產(chǎn)生；而且質(zhì)粒載體還包含了免疫刺激核苷酸序列［非甲基化胞苷酸鳥苷(Cytidinephosphateguanosine, CpG)］，可在動物中誘導(dǎo)強而持久的免疫應(yīng)答［5］。在針對Hp疫苗的研究過程中，國外已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)熱休克和過氧化氫酶的DNA疫苗，這些DNA疫苗在實驗中能夠激發(fā)機體的體液和細(xì)胞免疫，攻毒保護(hù)試驗也證實了DNA疫苗在Hp研究中的作用。近在采用尿素酶B亞單位構(gòu)建的DNA疫苗免疫研究發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗除了能夠夠激發(fā)機體的相應(yīng)的免疫應(yīng)答外，還可以激發(fā)機體的初始免疫應(yīng)答，能夠更有利的預(yù)防和清除感染。

    Ruggiero等認(rèn)為在細(xì)菌感染過程中，由于宿主和致病菌之間有著復(fù)雜的作用機制，單一抗原組分構(gòu)建的疫苗難以產(chǎn)生完全有效的保護(hù)作用，混合多抗原成分的疫苗可以激發(fā)機體更強的免疫應(yīng)答，將會是更完美的疫苗形式［6，7］。在Hp單個保護(hù)性抗原疫苗研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建的多亞單位疫苗具有Hp多個抗原組分，能夠激發(fā)機體產(chǎn)生比單一亞單位成分更強的免疫反應(yīng)，抗原成分相對全菌疫苗簡單，減少機體變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。國內(nèi)朱森林等分別構(gòu)建了表達(dá)UreB/HpaA、UreB/HspA雙價抗原的沙門氏減毒疫苗，動物保護(hù)實驗中證實比單一成分亞單位疫苗效果更好［810］。李明峰等［4］分別進(jìn)行了HspA/UreB、OMP/HspA融合蛋白多價疫苗構(gòu)建的研究，但是并沒有動物實驗的結(jié)果。Malfertheiner等在采用Vac、CagA、NAP的3個亞單位體外混合構(gòu)建的聯(lián)合疫苗研究中也取得了理想的結(jié)果，已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗研究。

    以融合基因方式獲得多組分疫苗與其他方式相比具有許多優(yōu)勢。我們在前期Hp疫苗的研究中，以基因融合的方式構(gòu)建分子內(nèi)佐劑融合疫苗，獲得很好的效果，也為融合基因方式構(gòu)建多亞單位疫苗研究打下了基礎(chǔ)。融合抗原在口服以及DNA的形式免疫小鼠都使小鼠產(chǎn)生了相應(yīng)的免疫應(yīng)答保護(hù)，得到了足夠的保護(hù)力。揭示在將來隨著Hp免疫保護(hù)機制逐步清除，更好的抗原選擇和組合，更好的免疫途徑，誘導(dǎo)一種正確的免疫反應(yīng)。Hp的感染是能夠被阻止，也是能夠可以清除的。

【參考文獻(xiàn)】
  　　1 朱森林，陳旻湖，陳 潔 et al. 優(yōu)化構(gòu)建UreB/HpaA雙價幽門螺桿菌減毒活菌疫苗的免疫保護(hù)作用 ［J］.中華消化雜志,2003;23(10):583586.

　　2 李 勣, 劉純杰, 李淑琴 et al. 幽門螺桿菌UreB及UreBHspA融合基因在減毒鼠傷寒沙門菌中的表達(dá)及小鼠的免疫應(yīng)答 ［J］. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2003;23(7):513516.

　　3 廖文俊, 陳旻湖, 朱森林 et al. UreA/KatA雙價減毒沙門菌疫苗株抗幽門螺桿菌的免疫保護(hù)作用 ［J］. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2001;21(6):642646.

　　4 李明峰, 何志勇, 凌 貞 et al. 幽門螺桿菌HspA和UreB雙價侯選疫苗株的構(gòu)建 ［J］. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2000;20(3):232235.

　　5 Lipford G B, Sparwasser T, Bauer M et al. Immunostimulatory DNA: sequencedependent production of potentially harmful or useful cytokines ［J］. Eur J Immunol, 1997; 27:34203426.

　　6 Mattsson A, QuidingJarbrink M, Lonroth H et al. Antibodysecreting cells in the stomachs of symptomatic and asymptomatic Helicobacter pylori infected subjects ［J］. Infect Immun, 1998; 66:27052712.

　　7 D’Elios M M, Manghetti M, Almerigogna F et al. Different cytokine profile and antigenspecificity repertoire in Helicobacter pylorispecific T cell clones from the antrum of chronic gastritis patients with or without peptic ulcer ［J］. Eur J Immunol, 1997; 27:17511755.

　　8 Bamford K B, Fan X, Crowe S E et al. Lymphocytes in the human gastric mucosa during Helicobacter pylori have a T helper cell 1 phenotype ［J］. Gastroenterology, 1998; 114:482492.

　　9 Goto T, Nishizone A, Fujika T et al. Local secretory immunoglobulin A and postimmunization gastritis correlate with protection agaist Helicobacter pylori infection after oral vaccination of mice ［J］. Infec Immun, 1999; 67(11):25312539.

　　10 Blanchard T G，Czinn S J，Maurer R et al. Ureasespecific monoclonal antibodies prevent Helicobacter felis infection in mice ［J］. Infect Immun, 1995; 63:13941399.

作者：袁小澎 鄒全明 洪愉 柏楊 吳超 張衛(wèi)軍

作者單位：第三軍醫(yī)大學(xué)檢驗系臨床微生物及免疫學(xué)教研室暨重慶市生物制藥工程技術(shù)研究中心，重慶 400038