恒定磁場對Schwann細(xì)胞氧化損傷的保護作用

【摘要】  目的：探討恒定磁場對Schwann細(xì)胞氧化損傷保護作用的機制。方法：用體外傳代純化培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞建立氧化損傷模型，將培養(yǎng)細(xì)胞分為氧化損傷組，恒定磁場（4?mT）保護組及正常組。采用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT）檢測細(xì)胞的活性，用生化技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛(MDA)的含量，用免疫組織化學(xué)方法檢測各組半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase3）的表達。結(jié)果：與正常組及保護組相比，HB2BOB2B處理組細(xì)胞活性降低（P＜0.01)，SOD含量明顯減少（P＜0.01)，MDA含量明顯增加（P＜0.01)，Caspase3表達呈強陽性，恒定磁場保護組細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.01),SOD含量較損傷組高（P＜0.01)，MDA含量明顯減少（P＜0.01)，Caspase3表達弱陽性。結(jié)論：4?mT恒定磁場能通過抗氧化損傷保護Schwann細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】  周圍神經(jīng)系統(tǒng) 模型 神經(jīng)學(xué) 損傷 細(xì)胞凋亡

      AProtective effects of the invariable magnetic field on

    oxidative injured Schwann cells

    ZHANG Jie, LI Zhenhua, SUN Jinhao, BAO Lihua, LIU Yuepeng

    （Department of Anatomy, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China）

    ［ABSTRACT］  ob[x]jective： To investigate the protective effects of the invariable magnetic field on  oxidative injured Schwann cells. Methods： Schwann cells were randomly divided into an experimental group and control groups. MTT was used to observe the cell activity of the Schwann cells with hydrogen peroxide. A biologic chemistry method was used to detect the content of intracellular superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde （MDA）. An immunohistochemistry method was used to detect the ex[x]pression of Caspase3. Results： The results showed that cell activity decreased in oxidative injured Schwann cells. However, these changes were significantly reversed in the  invariable magnetic field preconditioned group. Conclusion： An invariable magnetic field has a good antioxidant effect on Schwann cells.

    ［KEY WORDS］  Peripheral nervous system; Models, neurological; Injuries; Apoptosis    Schwann細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的膠質(zhì)細(xì)胞，包繞軸突形成有髓纖維或無髓纖維，并分泌多種與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生密切相關(guān)的神經(jīng)因子［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)后，氧自由基的增多導(dǎo)致Schwann細(xì)胞凋亡是周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機理之一［2］。本研究主要觀察了4?mT恒定磁場對氧化損傷模型中Schwann細(xì)胞的保護作用，為揭示恒定磁場治療周圍神經(jīng)病變提供理論依據(jù)。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    1.1.1  實驗試劑  DMEM/F12、胰蛋白酶均購自Gibco公司；噻唑藍［(34,5dimethylthiazolzyl)2,5diohenyltetraazolium bromide, MTT］、膠原酶由Sigma公司提供；S100 抗體、Caspase3 抗體系福建邁新公司產(chǎn)；胎牛血清(fetal calf serum, FCS)購自杭州四季青公司；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑、超氧化物歧化酶(hepatocuprein,SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

    1.1.2  實驗儀器  磁鐵由淄博市盛金磁鐵制造有限公司提供；CT3型特斯拉計系上海第四制表廠產(chǎn)； Multiskan MK3 酶標(biāo)儀購自芬蘭Labsystems公司；VC750超聲細(xì)胞粉碎機系Sonics Material INC公司產(chǎn)；隔音箱購自寧波新芝生物科技股份有限公司；UV2102PCS型尤尼柯紫外可見分光光度計由上海尤尼柯儀器有限公司提供；SHZ22水浴恒溫振蕩器系江蘇省太倉縣醫(yī)療器械廠產(chǎn)；旋渦震蕩器由江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠提供。

    1.2  方法

    1.2.1  Schwann細(xì)胞的純化及鑒定  將SD新生大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，固定在取材板上，分離坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)，置于DHanks液中，在解剖鏡下仔細(xì)剝離神經(jīng)外膜，盡可能去除神經(jīng)束膜，并剪成粒狀。用終濃度為0.125%的胰蛋白酶和0.03%的膠原酶兩種酶混合在一起進行消化，將獲取的細(xì)胞接種在含10%的FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每3?d換液1次，在培養(yǎng)3?d時做S100免疫組化染色，鑒定Schwann細(xì)胞，見圖1。

    1.2.2  實驗分組  細(xì)胞培養(yǎng)時分為3組。① 過氧化氫損傷組：在培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5%的H2O2；② 恒定磁場（4?mT）保護組：0.5%的H2O2＋恒定磁場；③正常對照組。

    1.2.3  MTT比色微量分析  細(xì)胞終止培養(yǎng)前4?h，每孔加入MTT溶液15?μl（5?mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4?h后吸取上清液，用DMSO溶解MTT結(jié)晶，然后將培養(yǎng)板放在Multiskan MK3酶標(biāo)儀上，試驗波長570?nm，測定每孔OD值。

    1.2.4  SOD的檢測  培養(yǎng)12?h后，收集Schwann細(xì)胞，用超聲細(xì)胞粉碎機對細(xì)胞進行粉碎，檢測各組細(xì)胞內(nèi)SOD的含量。

    1.2.5  MDA的檢測  培養(yǎng)12?h后，收集Schwann細(xì)胞，用超聲細(xì)胞粉碎機對細(xì)胞進行粉碎，檢測各組細(xì)胞內(nèi)MDA的含量。

    1.2.6  細(xì)胞內(nèi)Caspase3的表達  培養(yǎng)12?h時,取培養(yǎng)細(xì)胞做Caspase3免疫組織化學(xué)顯色，4%多聚甲醛固定30?min, 按SP方法進行二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色，陽性對照以PBS緩沖液替代一抗,顯微鏡觀察，細(xì)胞內(nèi)見棕黃色顆粒為陽性。

    2  結(jié)  果

    2.1  原代細(xì)胞培養(yǎng)及觀察  正常Schwann細(xì)胞呈梭形，胞體較小，有兩個細(xì)長的突起，48 72?h后去除阿糖胞苷，鏡下的Schwann細(xì)胞的純度明顯增加，見圖2。

    加入H2O2后，在倒置顯微鏡下觀察，膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生改變，細(xì)胞突起萎縮，胞體腫脹變圓，細(xì)胞數(shù)量減少，見圖3。恒定磁場保護組細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，可見Schwann細(xì)胞胞體梭形，突起較損傷組長，細(xì)胞數(shù)量多，見圖4。

    2.2  MTT檢測結(jié)果  與損傷組比較，恒定磁場保護組的OD值明顯增高（P＜0.05），見表1。

    OD 值損傷組0.663?0±0.128?1保護組正常組0.939?9±0.062?5*

    *2.3  SOD檢測結(jié)果  SOD檢測結(jié)果顯示，恒定磁場保護組的Schwann細(xì)胞的SOD值明顯高于損傷組（P＜0.05）,見表2。

    SOD活力（U/mg prot）損傷組20.097?7±0.112?4保護組29.342?4±0.045?6*正常組

    *2.4  MDA檢測結(jié)果  MDA檢測結(jié)果顯示，恒定磁場保護組的Schwann細(xì)胞的MDA值明顯低于損傷組（P＜0.05）,見表3。

    MDA（c/nmol·ml-1）損傷組58.799?8±1.779?5保護組11.199?9±0.025?3*正常組11.852?0±0.562?7*

    *2.5  各組之間Caspase3表達的形態(tài)學(xué)觀察  正常組Schwann細(xì)胞的Caspase3反應(yīng)呈弱陽性，細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒幾乎沒有，見圖5。損傷組呈強陽性，可見到陽性的棕色顆粒，見圖6。保護組呈弱陽性，棕色顆粒很少，見圖7。

    3  討  論

    近年來研究證明，周圍神經(jīng)損傷早期有一部分正常雪旺細(xì)胞Caspase3表達呈弱陽性（×200） Schwann細(xì)胞被動的被體內(nèi)新產(chǎn)生的氧化劑殺死。H2O2是一種強氧化劑，在紫外線或體液中金屬離子的作用下可產(chǎn)生O-2和OH-等多種自由基，并由此引發(fā)連鎖反應(yīng)產(chǎn)生更多自由基［3］，這些自由基能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Schwann細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞過度丟失，給外周神經(jīng)損傷修復(fù)帶來困難。因此如何保護Schwann細(xì)胞免于凋亡的丟失，成為研究的熱點。我們在實驗中觀察了HB2BOB2B造成的Schwann細(xì)胞氧化損傷以及恒定磁場的干預(yù)保護作用。

    已有研究表明［4］，作為抗氧化劑的SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除體內(nèi)超氧陰離子自由基，治療超氧陰離子自由基引起的疾病，保護細(xì)胞免受自由基的損傷，SOD活力的高低反應(yīng)了抗自由基能力的大小。Caspase3在細(xì)胞凋亡中起重要作用［5］：① 滅活阻止細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)；② 通過對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的直接酶解而促進凋亡；③ 通過對一些細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的酶解改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

    我們的實驗結(jié)果顯示，恒定磁場保護組的SOD含量較H2O2組明顯升高，MDA含量明顯降低，Caspase3反應(yīng)為弱陽性。表明恒定磁場具有一定抗氧自由基損傷作用，提示恒定磁場可保護Schwann細(xì)胞免受氧自由基的侵害。其具體機制可能與以下幾方面有關(guān):①SOD含有Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+等金屬離子,它們都是過渡元素,在3?d和4?s亞層都有未配對電子［6］。根據(jù)Keilmann［7］理論,磁場能夠影響電子自旋狀態(tài),造成不同電子自旋態(tài)的非熱平衡分布,從而影響SOD的活性,進而間接影響自由基反應(yīng)；②　自由基本身也是順磁性物質(zhì),具有自旋磁矩,會受到磁場的吸引［8］,因此磁場能直接作用于自由基,在磁場對運動電荷的洛侖茲力及磁場對運動電荷的轉(zhuǎn)動力矩作用下,影響自由基參與生理病理活動；③　MDA含量減少的原因［9］可能是磁場保護后SOD活性增加,其清除超氧陰離子自由基的能力加強,大量減少了羥自由基的生成,進而導(dǎo)致MDA含量的減少；脂類過氧化的中間產(chǎn)物如烷自由基、烷氧基、烷過氧基等脂性自由基帶有未抵消的電荷和磁矩,受磁場作用后它們的化學(xué)反應(yīng)速度會改變,有可能參與了減少MDA的生成。

    本實驗表明H2O2能夠誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞的氧化損傷，而恒定磁場具有顯著抑制Schwann細(xì)胞的氧化損傷作用，有利于Schwann細(xì)胞的存活，從而進一步揭示了恒定磁場促進周圍神經(jīng)再生的作用機理。

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