克服因突變KRAS表位的翻譯后修飾導(dǎo)致的免疫逃逸

克服因突變KRAS表位的翻譯后修飾導(dǎo)致的免疫逃逸，實現(xiàn)TCR-T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性

TCR-T細(xì)胞免疫療法，即通過基因工程使T細(xì)胞表達針對腫瘤表位的TCR，是一種過繼性細(xì)胞療法，已顯示出對多種腫瘤類型的有效性。致癌蛋白KRAS的突變體，特別是在G12位置的突變，是腫瘤發(fā)生的主要驅(qū)動因素，同時也是TCR-T細(xì)胞治療的理想靶點。然而，盡管有證據(jù)表明包含該突變的表位可以與HLA-A2結(jié)合并誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，但在表達常見的人類HLA-A2的腫瘤中，特異性針對G12突變KRAS表位的MHC I類限制性TCR仍然難以獲得。這里，弗雷德哈欽森癌癥研究中心研究發(fā)現(xiàn)，這種表位上的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）可能使腫瘤細(xì)胞逃避TCR-T細(xì)胞的免疫壓力。與未修飾的表位相比，Lys側(cè)鏈甲基化的KRAS-G12V肽可能由腫瘤細(xì)胞在HLA-A2上呈現(xiàn)，并影響TCR的識別。通過一種新的計算機指導(dǎo)方法設(shè)計TCR，通過誘變開發(fā)了能夠識別這種甲基化肽的TCRs，增強了對腫瘤的識別和破壞。此外，通過使用修飾后的肽刺激、克隆擴增和選擇，在罕見的原代T細(xì)胞的正常庫中鑒定出了具有相似功能活性的TCRs。從機制上講，為了確定腫瘤細(xì)胞如何甲基化或去甲基化這一表位的機制，進行了一項基因敲除篩選，揭示了SPT6作為一種去甲基化蛋白，可以通過靶向它來提高這些TCRs的效果。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了翻譯后修飾在免疫逃逸中的作用，并表明識別和靶向此類修飾應(yīng)有助于開發(fā)更有效的TCR-T細(xì)胞療法。

已報道針對由多個HLA（包括HLA-A3、HLA-A11和HLA-C8）提呈的含有G12突變的KRAS表位的TCR，這些TCR不僅在體外識別腫瘤，而且在體內(nèi)也表現(xiàn)出治療效果。然而，由于這些等位基因在美國人群中頻率較低（例如，HLA-A3為20-24%，而HLA-A11和HLA-C8更為罕見），這種治療方法的可及性受到限制。在美國，HLA-A2是常見的等位基因（47.6%）；因此，靶向A2限制性的KRAS表位將使更大比例的人群受益于治療。然而，定義一個A2限制性的KRAS表位已被證明存在問題，包括在質(zhì)譜（MS）靈敏度范圍內(nèi)確認(rèn)跨越G12位置的A2限制性表位存在于免疫肽組中的困難。然而，KRAS-G12V確實有預(yù)測與HLA-A2結(jié)合良好的表位，特別是5-14位殘基（KLVVVGAVGV）。由于MS已經(jīng)能夠從其他HLA等位基因中分離出含有G12V的表位和其他突變的KRAS表位，因此推測HLA-A2表位可能未被天然加工和/或未被HLA-A2有效提呈。

多種機制可能導(dǎo)致預(yù)測表位的處理或呈現(xiàn)缺陷，從而導(dǎo)致免疫逃逸。例如，蛋白酶體亞基的差異表達可以改變蛋白質(zhì)處理為表位的過程，加工后的表位向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸以結(jié)合MHC I的過程中出現(xiàn)缺陷，以及MHC I表達或結(jié)構(gòu)上的缺陷。此外，當(dāng)表位被呈遞時，它可能含有翻譯后修飾（PTMs），這會導(dǎo)致與未修飾表位反應(yīng)的TCR完全或部分喪失結(jié)合或識別該表位的能力。這些變化包括氧化、亞硝化、甲基化、磷酸化和糖基化；某些PTMs也可能由于惡性轉(zhuǎn)化和酶失調(diào)在腫瘤中更為普遍。在突變的KRAS中確實存在PTMs，并可能因遷移模式的改變而干擾MS檢測由HLA-A2呈遞的KRAS表位，這可能是關(guān)于A2表位缺乏共識的原因之一。

確定KRAS-G12V的一個可靶向表位并帶有PTM是具有挑戰(zhàn)性的，這主要是由于質(zhì)譜檢測PTM時的實驗和分析限制，以及在預(yù)測治療性TCR開發(fā)的表位時通常忽略了PTM。對于KRAS蛋白，已知PTM發(fā)生在C端區(qū)域，這些區(qū)域因其信號功能而被充分研究，以及N端區(qū)域的Lys-5側(cè)鏈甲基化，后者包含在預(yù)測由HLA-A2呈遞的表位中。

在這項研究中，證明了KRAS-G12V表位中Lys-5側(cè)鏈的甲基化可能干擾針對未修飾表位的TCR對KRAS-G12V腫瘤細(xì)胞系的靶向作用。通過結(jié)合基于機器學(xué)習(xí)的計算方法來模擬TCR:pMHC界面與高通量實驗篩選，開發(fā)了能夠靶向甲基化和未修飾表位的TCR，從而提供了更廣泛的針對HLA-A2+、KRAS-G12V+腫瘤細(xì)胞系的抗腫瘤活性。揭示了一種通常被認(rèn)為可以減少組蛋白甲基化的蛋白質(zhì)SPT6在減少KRAS-G12V表位甲基化中的潛在作用。這可能成為腫瘤細(xì)胞的一個靶點，以增強通過甲基化靶向的TCR-T細(xì)胞的免疫識別，并展示了抑制腫瘤逃避T細(xì)胞免疫的一種潛在協(xié)同策略。

HLA-A2呈遞的KRAS-G12V表位的PTM改變了其被MHC I類限制性TCR識別的情況，并阻止了腫瘤細(xì)胞的殺傷

通過NetMHCPan 4.1進行的計算預(yù)測，識別出HLA-A2呈遞的KRAS-G12V中包含G12V突變的多個表位G12V突變，其中由殘基5-14組成的表位（KLVVVGAVGV）被預(yù)測具有高的親和力。

為了初次開發(fā)針對該肽段的HLA-A2限制性TCR，從HLA-A2陽性的健康供體的PBMCs中分離了原代CD8+ T細(xì)胞，并通過使用自體APCs脈沖合成的KRAS-G12V 5-14肽（無任何PTMs）刺激來擴增表位反應(yīng)性克隆型。通過與HLA-A2:KRAS-G12V(5-14) Tetramer結(jié)合的限制濃度測量，分選對KRAS-G12V肽具有潛在高親和力的細(xì)胞。從分選的細(xì)胞中，使用ImmunoSEQ測定法（Adaptive Biotech）定量TCR克隆型，并通過單細(xì)胞RNA-seq鑒定配對的TCRα/TCRβ序列。在慢病毒骨架中合成在分選群體中優(yōu)先富集的TCR克隆型作為密碼子優(yōu)化的P2A連接構(gòu)建體的TCRα和TCRβ，并用于轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞。用梯度濃度的KRAS-G12V(5-14)肽刺激細(xì)胞，并測量產(chǎn)生的IFNγ表達以評估對這一肽的功能親和力。鑒定了兩個特別高親和力的TCR，即TCR19和TCR2，前者表現(xiàn)出高的功能親和力。然而，在與HLA-A2+、KRAS-G12V+的胰腺腺癌細(xì)胞系CFPAC1共培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)導(dǎo)了TCR19的CD8+ T細(xì)胞意外地顯示出比轉(zhuǎn)導(dǎo)了TCR2的T細(xì)胞更差的腫瘤生長抑制效果，而TCR19相反地在抑制DAN-G腫瘤細(xì)胞生長方面優(yōu)于TCR2，這些細(xì)胞也是HLA-A2+和KRAS-G12V+。

這種TCR功能親和力與不同腫瘤細(xì)胞殺傷之間差異的原因尚不清楚。一種可能的解釋是同種異體反應(yīng)性而非腫瘤抗原特異性。對于CFPAC1細(xì)胞的殺傷，TCR2對這一細(xì)胞系的同種異體反應(yīng)性不一定可以通過測量該TCR對由另一抗原呈遞細(xì)胞呈遞的肽段的劑量反應(yīng)來預(yù)測。然而，TCR2并未在不表達突變KRAS的其他靶標(biāo)上誘導(dǎo)對CFPAC1細(xì)胞上的任何I類HLA等位基因的反應(yīng)。另一種可能是，TCR19對DAN-G細(xì)胞的殺傷反映了同種異體識別，但類似的研究未檢測到TCR19對DAN-G細(xì)胞上等位基因的識別。因此，同種異體反應(yīng)性不太可能是解釋。假設(shè)，盡管這兩種HLA-A2+ KRAS-G12V+腫瘤細(xì)胞都可能呈遞該表位，但其中一種可能以修飾形式呈遞，而每種TCR對修飾和未修飾肽段的識別存在差異。

在更詳細(xì)地研究PTMs的存在之前，希望確認(rèn)預(yù)測的主要序列KRAS-G12V 5-14確實能夠通過蛋白酶體切割高效生成，并由HLA-A2呈遞。為此，使用了ARTEMIS技術(shù)，該技術(shù)包括基于質(zhì)譜鑒定與所選HLA I的分泌單鏈二聚體（SCD）結(jié)合的MHC I表位。這提供了一個豐富的、易于純化的肽結(jié)合I類分子來源，可以檢測大多數(shù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中內(nèi)源性加工并加載到I類分子上的肽，并克服了使用質(zhì)譜識別特定I類等位基因在細(xì)胞表面呈遞的有限數(shù)量肽的挑戰(zhàn)。在293F細(xì)胞系中建立ARTEMIS系統(tǒng)，該細(xì)胞系相比其他哺乳動物細(xì)胞系支持異常豐富的蛋白質(zhì)表達。293F細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達了分泌型HLA-A2 SCD以及KRAS-G12V蛋白的截短版本（aa1-100，使蛋白失去功能但保留包含G12V突變的N端部分），以增加含有G12V突變的KRAS-G12V來源肽的可用性，以便與HLA-A2結(jié)合。通過ARTEMIS鑒定出3種由HLA-A2呈遞的KRAS肽，其中包括KRAS-G12V 5-14肽，這是一個含有突變G12V殘基的HLA-A2呈遞肽。這些結(jié)果證實，5-14表位是與HLA-A2相關(guān)的KRAS-G12V抗原處理和呈遞的主要產(chǎn)物，也是用TCR靶向的正確肽序列。

鑒于在突變KRAS驅(qū)動的癌癥中已知的甲基化過程失調(diào)，以及先前檢測到Ras家族蛋白Lys-5側(cè)鏈甲基化，考慮腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)的KRAS-G12V 5-14表位可能包含一定程度的甲基化或其他PTMs的可能性。在確認(rèn)了表位的主要序列后，假設(shè)DAN-G細(xì)胞呈現(xiàn)的KRAS-G12V 5-14表位可能是Lys-5甲基化和未修飾表位的某種組合。因此，弱識別的修飾表位的存在可能限制了這些腫瘤細(xì)胞被TCR2和TCR19識別，從而限制了腫瘤殺傷。然而，由于293F細(xì)胞可能不具備與DAN-G相同的蛋白質(zhì)甲基化機制，嘗試在DAN-G細(xì)胞中設(shè)計ARTEMIS。不幸的是，由于培養(yǎng)的DAN-G細(xì)胞密度低，且蛋白質(zhì)表達水平低于基于293的ARTEMIS細(xì)胞，未能檢測到足夠的肽以識別甲基化表位。因此，為了尋找可能導(dǎo)致DAN-G細(xì)胞內(nèi)KRAS甲基化增加的甲基化活性差異，還從DAN-G和CFPAC1細(xì)胞中進行了全蛋白KRAS的免疫沉淀，隨后進行液相色譜-質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，在DAN-G細(xì)胞中，但在CFPAC1細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)Lys-16側(cè)鏈三甲基化，代表胺基團中的所有氫原子被甲基完全取代。在這組數(shù)據(jù)中，未能回收或檢測到含有KRAS Lys-5的肽，這可能是由于在樣本處理過程中胰蛋白酶在Lys-5后立即切割KRAS蛋白，產(chǎn)生了短的5-mer肽，難以用質(zhì)譜技術(shù)檢測。因此，雖然無法直接確認(rèn)Lys-5甲基化肽的存在，但DAN-G細(xì)胞中KRAS Lys甲基化的增加模式是明顯的。此外，先前的報道清楚地表明，KRAS在Lys殘基上存在甲基化，包括Lys-5的二甲基化。Lys側(cè)鏈甲基化可以是一甲基化、二甲基化或三甲基化，前兩種狀態(tài)是完全甲基化的中間程度。

為了確定帶有Lys-5甲基化的KRAS-G12V(5-14)肽是否與未修飾的肽以相似的親和力結(jié)合HLA-A2，評估了HLA-A2:KRAS-G12V pMHC復(fù)合物在有無Lys-5側(cè)鏈甲基化情況下的穩(wěn)定性。T2細(xì)胞缺乏抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白（TAP），細(xì)胞表面表達的正確折疊的I類分子很少。用外源肽脈沖T2細(xì)胞可以穩(wěn)定細(xì)胞表面HLA-A2分子的構(gòu)象，從而增強表面表達，這與肽對HLA-A2的親和力相關(guān)。用帶有或不帶甲基化的KRAS-G12V(5-14)肽脈沖T2細(xì)胞，并測量了HLA-A2的表面表達。與未處理的對照細(xì)胞相比，當(dāng)T2細(xì)胞被KRAS-G12V(5-14)肽脈沖時，HLA-A2的表面表達更高。此外，用含有不同程度Lys-5甲基化的相同肽脈沖進一步增加了A2的表達，表明甲基化可能增強表位的穩(wěn)定呈現(xiàn)。盡管未修飾的肽被兩種TCR都很好地識別，但這些TCR識別甲基化表位的能力存在。因此，Lys5的不同甲基化可能解釋了這些TCR在殺傷不同腫瘤細(xì)胞時觀察到的差異。

除了從ARTEMIS檢測到的10-mer KRAS-G12V 5-14序列外，另一個預(yù)測的含有G12V突變的表位是9-mer（LVVVGAVGV），該表位能與HLA-A2結(jié)合，之前的研究也報告了通過肽段剪接產(chǎn)生的含有KRAS-G12V 5-6/8-14殘基的HLA-A2呈遞表位。為了排除這些替代表位被TCR識別的可能性，并測試甲基化表位的識別情況，合成了這些表位變體以及KRAS-G12V(5-14)，包括在Lys-5處進行PTM的多肽。為了確定這些變異表位對TCR的功能親和力，用這些由HLA-A2呈遞的表位刺激表達TCR2或TCR19的T細(xì)胞，并測量了隨后的IFNγ表達。確實，雖然TCR2和TCR19都以相似的程度識別未甲基化的KRAS-G12V 5-14，但只有TCR19對Lys-5側(cè)鏈氨基甲基化的多肽產(chǎn)生了反應(yīng)。其他形式的含有G12V的表位，其預(yù)測的結(jié)合能力較低（如6-14或5-12殘基），以及先前認(rèn)為可能被處理的另一種剪接肽KRAS-G12V 5-6/8-14，均未能引發(fā)TCR的反應(yīng)。因此，DAN-G細(xì)胞系可能對其部分KRAS-G12V蛋白或由此產(chǎn)生的表位進行了Lys-5側(cè)鏈甲基化修飾，使得這種腫瘤細(xì)胞呈遞的表位無法被TCR2識別。Lys-5甲基化的存在與先前研究中關(guān)于RAS家族蛋白，包括KRAS的甲基化結(jié)果一致，并且與已知的在突變KRAS驅(qū)動的癌癥中蛋白質(zhì)甲基化的失調(diào)相符。

基于支持Lys-5甲基化肽對HLA-A2呈遞的KRAS-G12V(5-14)表位TCR識別貢獻的證據(jù)，試圖確定這種甲基化可能導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化。使用Rosetta蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模工具，在Lys-5側(cè)鏈上引入了單甲基化、二甲基化和三甲基化，并評估了肽在MHC裂隙中定位的變化。這一計算流程表明，在HLA-A2呈遞的KRAS-G12V(5-14)中，Lys-5側(cè)鏈的甲基化會誘導(dǎo)該側(cè)鏈氨基位置的變化，這可能影響TCR對該表位的識別：在未修飾的肽中，Lys-5側(cè)鏈的氨基從MHC I裂隙中突出，可能接近TCR鏈，表明它可能作為TCR與pMHC復(fù)合體之間的接觸點。單甲基化導(dǎo)致氨基被甲基推入MHC I裂隙更深處，而二甲基化或三甲基化則進一步加劇了這一點，這可能解釋了甲基化對TCR2或TCR19識別此pMHC復(fù)合體的影響。

為了評估Lys-5殘基對每個TCR與HLA-A2呈遞的KRAS-G12V表位結(jié)合的相對貢獻，進行了丙氨酸掃描實驗，即依次將HLA-A2呈遞的表位中的每個殘基替換為小而中性的Ala氨基酸。然后，每種單個Ala取代的表位用于脈沖抗原呈遞細(xì)胞，以刺激表達TCR2或TCR19的CD8+ T細(xì)胞，并測量IFNγ以確定整個表位的識別是否受到Ala取代的影響，這表明被取代的氨基酸是TCR的相關(guān)接觸點。5-14表位的第11位殘基已經(jīng)是Ala，因此用Thr或Gly替代。在肽濃度為0.1μg/ml時，分析顯示Lys-5被替換為Ala后，TCR2對表位的反應(yīng)從67.9%的反應(yīng)性細(xì)胞減少到2.45%，表明TCR2對該表位位置的變化敏感。Rosetta建模的pMHC復(fù)合物與KRAS-G12V表位也顯示Lys-5側(cè)鏈從HLA-A2的溝槽中伸出，朝向可以與TCR相互作用的方向。相比之下，TCR19的丙氨酸掃描實驗顯示，其對KRAS-G12V表位大多數(shù)位置的氨基酸取代具有高耐受性，這可能解釋了其對甲基化Lys-5的識別，但也表明它可能是多態(tài)的，作為潛在治療性TCR進行改進時不太合適。

圖S1 HLA-A2呈遞的 KRAS-G12V表位包含一個Lys殘基，該殘基可以穩(wěn)定呈遞，并且其側(cè)鏈可能被甲基化。

采用合理突變方法生成識別甲基化KRAS-G12V表位的TCR，以提高對腫瘤細(xì)胞的靶向性

識別能夠單獨或與未修飾肽一起識別KRAS-G12V 5-14肽Lys-5側(cè)鏈單、二和/或三甲基化的TCR，可能增加對具有KRAS-G12V突變的HLA-A2+腫瘤進行治療性靶向的能力。為了生成新的能夠針對具有3種不同程度Lys-5甲基化肽的TCR，首先探索了一種策略，即對現(xiàn)有TCR（TCR2）的CDR3α區(qū)域進行突變，該TCR以高功能親和力和特異性識別未修飾的KRAS-G12V表位，以確定是否可以在不獲得更廣泛的非特異性的情況下擴展肽識別范圍，包括甲基化變體。

為了確定這個TCR可能與甲基化位點相互作用的區(qū)域，開發(fā)了一個新的計算結(jié)構(gòu)預(yù)測工作流程（圖S1g）。首先使用了Alphafold，該工具利用基于深度學(xué)習(xí)的方法來預(yù)測TCR:pMHC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，而不考慮任何PTMs，因為后者在Alphafold中建模不佳。將輸出結(jié)果輸入到Rosetta中，該工具利用基于物理的能量函數(shù)來允許對結(jié)構(gòu)進行額外的分子變化建模，例如向表位引入PTMs，然后重新調(diào)整結(jié)構(gòu)預(yù)測。工作流程應(yīng)用于現(xiàn)有的能夠識別由HLA-A2呈遞的未修飾KRAS-G12V 5-14肽的TCR2，揭示了CDR3α區(qū)域內(nèi)的一段核心序列，這段序列有可能靠近Lys-5側(cè)鏈及其任何潛在的甲基化修飾。

以結(jié)構(gòu)模型為指導(dǎo)，創(chuàng)建了一個合理化的突變庫，針對計算確定的核心CDR3α序列。將該庫轉(zhuǎn)導(dǎo)到CD8+ Jurkat細(xì)胞中，刺激細(xì)胞以檢測能夠識別不同修飾形式的KRAS-G12V 5-14肽的TCR克隆型。轉(zhuǎn)導(dǎo)了該庫的T細(xì)胞被分析與未甲基化或Lys-5-甲基化的KRAS-G12V(5-14)肽的結(jié)合情況。觀察到對這兩種肽之一或兩者都表現(xiàn)出廣泛的反應(yīng)性，證實了計算確定的CDR3α序列在TCR2識別假設(shè)的Lys-5甲基化位點中起關(guān)鍵作用。鑒定了幾種不同的克隆型，它們能夠僅與未甲基化肽結(jié)合，或與未甲基化和單/二/三甲基化表位組合結(jié)合，或僅與甲基化肽結(jié)合，這些克隆型被測序以鑒定相應(yīng)的突變變體。然后生成了表達這些突變變體TCR的新構(gòu)建體。使用未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位分別進行了劑量反應(yīng)測定，以評估轉(zhuǎn)導(dǎo)了每個突變變體的CD8+ T細(xì)胞。與TCR2相比，一些突變化的TCR對甲基化表位的識別有所改善。劑量反應(yīng)測定顯示，突變化的TCR與TCR2相比，并沒有獲得對野生型KRAS 5-14或替代的KRAS-G12D 5-14表位的識別能力。因此，僅在計算識別的核心CDR3α序列內(nèi)發(fā)生的氨基酸變化能夠改變TCR對帶有PTMs的肽段的識別模式，而不會改變對非G12V KRAS表位的識別。對于TCREDST，標(biāo)記為突變的"核心"CDR3α序列，與HLA-A2呈遞的KRAS-G12V表位上的Lys-5側(cè)鏈氨基酸是Asn和Ser。這些氨基酸分別帶負(fù)電荷和極性，可以與KRAS-G12V表位上的Lys-5側(cè)鏈氨基基團發(fā)生靜電或氫鍵相互作用。盡管甲基化引入了疏水的甲基基團，但該TCR上的氨基酸的極性性質(zhì)仍可能允許其與Lys側(cè)鏈結(jié)合。

隨后測試了表達增強結(jié)合甲基化肽段的TCR變體的CD8+ T細(xì)胞是否能夠有效識別并殺傷表達KRAS-G12V的腫瘤細(xì)胞。在與表達KRAS-G12V和HLA-A2的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時，表達TCREDST或TCREDRS的CD8+ T細(xì)胞，這些T細(xì)胞能夠識別未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位，顯示出對DAN-G細(xì)胞的殺傷能力提高，而DAN-G細(xì)胞可能呈現(xiàn)未甲基化和甲基化的KRAS-G12V(5-14)，并且與TCR2相比，對CFPAC-1細(xì)胞的殺傷能力相似。與肽劑量反應(yīng)實驗中無法識別野生型KRAS 5-14或KRAS-G12D(5-14)的結(jié)果一致，這些TCR沒有抑制僅表達野生型KRAS 5-14的HeLa細(xì)胞或表達KRAS-G12D的Panc1細(xì)胞的生長。綜上所述，對天然分離的TCR2進行突變產(chǎn)生了新的TCR，這些TCR能夠識別不同的未修飾和不同程度甲基化的KRAS-G12V表位，而不會增加對G12D或野生型KRAS表位的"off-target"識別。

TCR在ACT中應(yīng)用的一個關(guān)鍵問題是特異性必須僅限于預(yù)期目標(biāo)，以避免脫靶毒性，這在天然分離的TCR發(fā)生突變后尤為令人擔(dān)憂。為了進一步評估所選TCR的特異性，再次在表達CD8αβ、TCR2或TCR19以及Nur77-GFP報告基因作為TCR信號傳導(dǎo)特異性標(biāo)志的Jurkat報告細(xì)胞中，對目標(biāo)表位進行了丙氨酸掃描，以識別突變TCR的結(jié)合情況。在0.1μg/ml肽濃度下，定義耐受性為保留>35%響應(yīng)細(xì)胞的Nur77-GFP報告基因表達，結(jié)果顯示表位上有特定位置可以耐受氨基酸替換并保持刺激性。總體耐受模式為K-x-x-V-V-x-A-x-x-x，其中x表示該位置可耐受Ala替代。值得注意的是，雖然一些TCR能夠識別未甲基化和甲基化的Lys-5側(cè)鏈，但將Lys-5替換為Ala會導(dǎo)致對呈遞肽的識別喪失。識別的減少程度大于在其他肽位點發(fā)生替換時觀察到的程度，表明這個Lys氨基酸仍然是突變TCR的主要接觸點，就像它對TCR2一樣。對人類肽組進行掃描，尋找能夠容納這些容許殘基任何替換的表位，得到了PLD3 396-405、MIGA1 74-83、NAGPA 276-285、K/N/HRAS 5-14、RSLBB 35-44、CFA61 23-32/607-616/667-676、CUL9 635-644/745-754、CLCN6 80-89和MACOI 33-42作為潛在的off-target命中。合成這些肽，并用于刺激TCR-T細(xì)胞。與HLA-A2呈遞的KRAS-G12V 5-14相比，所有選定的TCR在0.1μg/ml濃度下對這些肽的反應(yīng)都減弱了，這表明突變的TCR沒有獲得的多態(tài)性，與原始的TCR2相比。此外，對于TCR2和TCREDST，在更生理的0.01μg/ml濃度下，這些肽引起的反應(yīng)率低于6%，而KRAS-G12V表位的反應(yīng)率為18-19%，通過IFNγ表達細(xì)胞的百分比測量。

選定的肽刺激原代T細(xì)胞并進行克隆擴增，揭示了來自健康供體庫的能識別甲基化KRAS-G12V表位并能靶向腫瘤細(xì)胞的TCR

通過誘變方法生成的TCR能夠特異性地靶向并有效殺傷表達KRAS-G12V及其PTMs的HLA-A2腫瘤細(xì)胞系。然而，這些TCR未經(jīng)胸腺選擇過程的天然篩選，因此盡管基于丙氨酸掃描的安全性測試，仍可能存在與其他人類蛋白質(zhì)組肽交叉反應(yīng)的風(fēng)險。因此，為了從正常外周庫中鑒定出可能與甲基化KRAS表位結(jié)合的TCR，從健康供者的PBMC中分離的原代人T細(xì)胞被用KRAS-G12V肽（包括未甲基化、單甲基化、二甲基化和三甲基化Lys-5）刺激，并根據(jù)對含有特定HLA-A2:PTM的KRAS-G12V 5-14 Tetramer在限制性肽濃度下的特異性結(jié)合進行分選純化。對純化的細(xì)胞群進行了定量TCR庫分析，并合成了高度富集的TCR克隆型并在原代CD8+ T細(xì)胞中表達。

通過檢測TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞在暴露于由HLA-A2呈遞的未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位后的IFNγ表達，這些TCR表現(xiàn)出對G12V突變具有劑量反應(yīng)模式，對甲基化和/或未甲基化的肽有反應(yīng)，并且不識別野生型或G12D突變表位這些TCR，包括TCRA2UoM1-1、TCRA2UoM1-2和TCRA2UoM1-4，對未甲基化和單甲基化肽的功能親和力與突變衍生的TCR相當(dāng)，特別是TCREDST，其對DAN-G細(xì)胞的殺傷能力更強，并且對未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位有強烈的識別。在對甲基化和未修飾肽表現(xiàn)出強識別的TCR中，表達TCRA2UoM1-1的CD8+ T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時，顯示出比表達TCR2的T細(xì)胞對HLA-A2+ KRAS-G12V+ DAN-G腫瘤細(xì)胞系的殺傷能力更強，推測該細(xì)胞系呈現(xiàn)甲基化和未甲基化的KRAS-G12V 5-14。TCRA2UoM1-1對CFPAC1的殺傷能力與其他TCR相似，后者可能呈現(xiàn)未甲基化的KRAS-G12V 5-14。TCRA2UoM1-1不識別滴定劑量的HLA-A2呈遞的野生型KRAS 5-14或KRAS-G12D 5-14，但對表達野生型或G12D KRAS的HLA-A2+腫瘤細(xì)胞系顯示出一定的抑制作用，表明可能存在更廣泛的靶向。然而，使用TCRA2UoM1-1進行的丙氨酸掃描顯示，對KRAS-G12V 5-14表位內(nèi)的氨基酸替代非常有限的耐受性，以至于在人類肽組中潛在的匹配項是EPIPL 1948-1957。使用該肽進行的劑量反應(yīng)試驗顯示，該TCR對其沒有識別，證實了其高度選擇性的特異性。

TCRA2UoM1-1的結(jié)構(gòu)建模揭示了一個CDR3α序列，該序列中Asn和Ser與Lys-5 側(cè)鏈及其不同甲基化形式為接近。這些TCR氨基酸與在突變體TCREDST中鑒定出的相同，因此可能允許這兩個TCR與KRAS-G12V表位的甲基化和非甲基化Lys-5均有緊密相互作用。

SPT6參與腫瘤細(xì)胞中KRAS-G12V表位Lys-5去甲基化的機制，可能是創(chuàng)建穩(wěn)定表位并用甲基化特異性TCR進行呈遞的靶點

接下來試圖確定可能參與KRAS-G12V表位甲基化的基因。為此，進行了一項CRISPR-Cas9文庫篩選，針對已知與DNA或蛋白質(zhì)甲基化相關(guān)的基因。該文庫被轉(zhuǎn)導(dǎo)到DAN-G細(xì)胞系中，該細(xì)胞系被認(rèn)為表達甲基化的KRAS-G12V(5-14)表位，并且能夠被具有甲基化表位特異性的TCR識別，但不能有效被僅對未修飾表位特異的TCR識別。在與甲基化反應(yīng)性TCR-T細(xì)胞（TCREDST）和優(yōu)先靶向未修飾KRAS的TCR-T細(xì)胞（TCR2）共培養(yǎng)前后收集了腫瘤細(xì)胞，并確定了存活腫瘤細(xì)胞中每種gRNA的頻率。選擇TCREDST作為比較中的甲基化敏感TCR，因為它與TCR2的不同在于能夠識別甲基化Lys-5。分析顯示，在與TCREDST共培養(yǎng)時，某些基因敲除的恢復(fù)率降低，而在與TCR2共培養(yǎng)時則沒有這種現(xiàn)象，這表明敲除的基因可能賦予了腫瘤細(xì)胞生存劣勢，這可能是由于甲基化表位的呈現(xiàn)增加所致。相反，在相同共培養(yǎng)比較中，針對某個基因的gRNA頻率較高意味著敲除賦予了生存優(yōu)勢，從而通過減少甲基化表位的呈現(xiàn)提供了免疫逃逸的手段。

在基因敲除篩選中，DAN-G細(xì)胞中SUPT6H敲除（編碼SPT6蛋白）的細(xì)胞是與甲基化靶向的TCREDST-T細(xì)胞共培養(yǎng)相比，非甲基化靶向的TCR2-T細(xì)胞共培養(yǎng)中減少的敲除細(xì)胞。這表明SPT6表達降低了該表位的甲基化。SPT6 傳統(tǒng)上被認(rèn)為是組蛋白Lys甲基化的負(fù)調(diào)控因子。從數(shù)據(jù)來看，SPT6似乎具有非傳統(tǒng)的抑制KRAS-G12V表位Lys甲基化的作用。

為了進一步研究針對SPT6缺陷型DAN-G細(xì)胞的甲基化靶向TCR-T細(xì)胞的增強效果，創(chuàng)建了一個SUPT6H基因敲除的DAN-G細(xì)胞系。通過目標(biāo)基因組區(qū)域的長讀測序驗證了成功的敲除。將SUPT6H敲除的DAN-G細(xì)胞與轉(zhuǎn)導(dǎo)了TCREDST（靶向未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位）或TCR2（僅有效靶向未甲基化的KRAS-G12V表位）的CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)，證實了SUPT6H的敲除增加了表達TCREDST或TCRA2UoM1-1（也靶向甲基化表位）的T細(xì)胞的殺傷敏感性。此外，敲除并未增加表達對甲基化無反應(yīng)的TCR2的T細(xì)胞的殺傷作用。相對于原始的DAN-G細(xì)胞，SUPT6H敲除并未增加HLA-A2的表達，也未改變KRAS的表達水平，表明SUPT6H敲除的效果并非由于總表位呈現(xiàn)水平的變化，而是由于表位的PTM組成的變化。

來自TCGA的數(shù)據(jù)表明，在攜帶KRAS-G12V突變的癌癥患者群體中，SUPT6H的功能喪失型突變導(dǎo)致生存期增加，與整個SUPT6H突變患者群體相比。這種特定突變的行為可能表明，在天然存在的TCR庫背景下，甲基化的KRAS-G12V表位具有更強的自發(fā)免疫原性，這與之前描述的情況一致，即當(dāng)表位被甲基化時，HLA-A2:KRAS-G12V pMHC復(fù)合物在細(xì)胞表面的表達更加穩(wěn)定，而未甲基化時則不然。

總結(jié)

開發(fā)有效的采用細(xì)胞療法使用TCR需要準(zhǔn)確識別由靶向腫瘤特異性呈現(xiàn)的表位，這在PTM的背景下會變得越來越困難。在這項研究中，通過兩種方法證明了分離/生成能夠識別和靶向可改變腫瘤表位免疫原性的PTM的TCR的能力。深度學(xué)習(xí)指導(dǎo)的突變使優(yōu)化一種潛在有前景的針對HLA-A2呈遞的KRAS-G12V表位的TCR成為可能，使其能夠同時靶向該表位的翻譯后修飾和未修飾變體，從而實現(xiàn)對HLA-A2+、KRAS-G12V腫瘤細(xì)胞類型的更有效殺傷。還通過選擇性擴增來自健康供者原代T細(xì)胞群體中對修飾和未修飾KRAS-G12V肽變體反應(yīng)的罕見克隆型，生成了能夠?qū)崿F(xiàn)類似活性的TCR，從而選擇經(jīng)過胸腺中樞耐受過程的TCR，這意味著它們不太可能對自身抗原產(chǎn)生反應(yīng)，并可能提供安全的治療譜型。對于可能同時呈現(xiàn)未修飾KRAS-G12V表位及其不同程度Lys-5甲基化變體的腫瘤細(xì)胞，數(shù)據(jù)表明，設(shè)計或選擇能夠靶向這些變體廣泛范圍的治療性TCR將更有效地殺傷更大比例的KRAS-G12V表達腫瘤細(xì)胞，并防止因KRAS Lys甲基化改變或變異導(dǎo)致的免疫逃逸。

計算預(yù)測TCR對pMHC復(fù)合物的特異性取得了進展，但純計算方法仍需實驗驗證以確定TCR特異性是否足夠高，以確?？鼓[瘤治療的安全性和有效性。預(yù)測pMHC復(fù)合物與TCR之間的三維結(jié)構(gòu)，有可能為基于提議的接觸點、肽在pMHC內(nèi)的取向以及TCR對該復(fù)合物的取向，實驗性地修改和提高TCR對pMHC的親和力/特異性提供見解。然而，由于可用于新預(yù)測的基礎(chǔ)的實驗驗證的TCR:pMHC相互作用結(jié)構(gòu)數(shù)量仍然相對有限，預(yù)測模型傾向于根據(jù)現(xiàn)有的常見表位過度擬合，以及缺乏陰性對照數(shù)據(jù)，TCR:pMHC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)歷來難以準(zhǔn)確計算確定。計算蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測創(chuàng)新，包括Alphafold，已經(jīng)提高了準(zhǔn)確性。盡管如此，由于缺乏包含PTMs的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練，Alphafold目前還不支持PTMs變化的結(jié)構(gòu)預(yù)測。相比之下，Rosetta利用基于物理的能量函數(shù)優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這更好地適應(yīng)了將PTMs整合到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測中。因此，在本研究中，將這兩種結(jié)合成一種預(yù)測，生成了一個更精確的指南，能夠準(zhǔn)確識別TCR CDR3序列內(nèi)的pMHC接觸位點，這些位點隨后可以通過飽和突變進行修飾，以特異性增強TCR與pMHC復(fù)合物內(nèi)翻譯后修飾肽的關(guān)聯(lián)。這一策略使我們能夠開發(fā)出新的TCR，更有效地靶向HLA-A2+ KRAS-G12V+腫瘤，同時保持TCR對突變KRAS的特異性。

MS技術(shù)的發(fā)展，包括具有更高靈敏度的新技術(shù)，使得其可用于鑒定MHC I類限制性T細(xì)胞表位。在本研究中，使用了這種MS來表征由HLA-A2呈遞的含KRAS-G12V表位的主要序列，類似于先前研究中鑒定由其他MHC I等位基因呈遞的突變KRAS表位的研究。這些基于MS的研究對于開發(fā)潛在治療性TCR以針對突變KRAS腫瘤非常重要。然而，MS在檢測PTMs方面仍可能不可靠。由于腫瘤表達的多種MHC I和II等位基因所呈現(xiàn)的免疫肽組較大、腫瘤細(xì)胞的MHC表達通常減少、蛋白質(zhì)捕獲的低產(chǎn)率以及某些感興趣蛋白質(zhì)的低表達，可能導(dǎo)致特定表位及其相關(guān)PTMs的檢測靈敏度不足。因此，基于MS的工作流程可以從大化蛋白質(zhì)表達和MHC捕獲中受益，正如本研究中使用ARTEMIS所做的那樣。此外，在樣品處理過程中引入化學(xué)偽影，如氧化，可能會混淆檢測到的PTM是否真實存在，而事先未懷疑某肽上存在PTM可能會導(dǎo)致該肽的漏檢。為了繞過與表位檢測相關(guān)的這些困難，并探查呈遞表位上的特定PTM，可以使用具有不同PTM-肽識別模式的TCR作為MS的替代方法，因為這些TCR會在靶標(biāo)呈遞具有特定PTM時引發(fā)T細(xì)胞活化，并且可以作為檢測PTM是否存在的一種非常敏感的測定方法。

基于這里為生成針對HLA-A2呈遞的KRAS-G12V的TCR所做的努力，TCREDST和TCRA2UoM1-1似乎是進一步開發(fā)為治療性TCR的兩個有希望的候選者。前者是通過突變一種天然識別源自突變KRAS的未修飾表位的現(xiàn)有TCR而產(chǎn)生的，而后者則是從健康供體的TCR庫中篩選出來的。突變方法可以生成可能不存在于正常庫中的TCR，并且對目標(biāo)的親和力更高。然而，由于這些TCR序列是從天然存在于庫中的TCR突變而來，它們在發(fā)育過程中沒有經(jīng)過對自身免疫肽組的自然篩選，因此在治療環(huán)境中存在更高的脫靶活性風(fēng)險。測試TCR對交叉反應(yīng)靶點的識別，如通過丙氨酸掃描后鑒定并測試潛在的非KRAS-G12V靶點來進行的，有助于緩解這一問題。此外，此類TCR可用作探針，以識別不同腫瘤呈遞的表位上特定的PTM的存在。理論上，從已經(jīng)中心胸腺耐受的健康供體庫中發(fā)現(xiàn)的TCR比通過突變生成的TCR安全，但如果所需的TCR克隆型在庫中特別稀少或僅有低親和力，則可能會受到限制?？傮w而言，證明了這兩種方法都能生成可能有效的、能夠針對修飾和/或未修飾腫瘤抗原的治療性TCR。

研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基化抑制劑SPT6（SUPT6H）進一步證明了蛋白質(zhì)PTMs可能通過潛在的非經(jīng)典過程引入，類似于SMYD3展示出的非經(jīng)典甲基化活性，這種活性影響KRAS信號通路的其他成分。從研究結(jié)果來看，在腫瘤細(xì)胞中敲除SUPT6H可以增強針對KRAS、對PTM有反應(yīng)的TCR-T細(xì)胞的療效。減少SPT6的活性可能為提高腫瘤免疫原性提供另一種機會，例如將這些TCR-T細(xì)胞與SPT6的小分子抑制劑聯(lián)合使用。

對KRAS-G12V抗原Lys甲基化的研究揭示了蛋白質(zhì)PTMs在改變細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞中所起的有趣作用，并提供了一種策略來減輕PTMs的影響，以生產(chǎn)性能更加一致的治療性TCR。此前已有研究表明，腫瘤相關(guān)抗原的PTMs可改變多種腫瘤類型的腫瘤細(xì)胞的免疫原性，研究在此基礎(chǔ)上描述了一種開發(fā)特異性靶向這些修飾的TCR的策略。這一策略為開發(fā)特異性靶向PTMs的TCR開辟了新途徑，為個性化免疫療法提供了新的方向。此外，已經(jīng)鑒定出能夠靶向并殺傷攜帶KRAS-G12V突變的腫瘤細(xì)胞的TCR，并且這些TCR受常見的HLA等位基因限制，因此具有的臨床開發(fā)潛力。鑒于KRAS-G12V突變在多種不同腫瘤類型中的廣泛表達，包括許多實體瘤，這些TCR可能使ACT得以發(fā)展，以對抗這些通常難以治療的腫瘤。

腫瘤抗原上發(fā)現(xiàn)的PTMs在改變腫瘤細(xì)胞免疫原性之外的作用可能非常廣泛。以HLA-A2呈遞的KRAS-G12V為例，有人推測KRAS中Lys-5的甲基化可能會影響Ras家族信號通路中相關(guān)信號蛋白的相互作用。闡明腫瘤抗原上PTMs的機制原因及其后果，可能會為可能的分子途徑提供額外的見解，這些途徑可以與針對這些抗原的免疫療法協(xié)同或獨立地進行靶向治療。