使用單個B細胞技術(shù)制備兔單克隆抗體

單克隆抗體的制備是一項復(fù)雜而精細的工作，單B細胞抗體開發(fā)技術(shù)是近年來新興的單克隆抗體制備技術(shù)。它是將單細胞分離鑒定技術(shù)結(jié)合多種PCR技術(shù)形成的一種單克隆抗體體外篩選及表達體系，以單個B細胞為起始點，利用每個B細胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從單個B細胞中擴增出抗體基因，進而獲得抗原特異性抗體。

B細胞單克隆抗體制備技術(shù)具有高通量、高效率、低細胞數(shù)等優(yōu)點，所制備的抗體保留了豐富的基因多樣性及輕重鏈可變區(qū)天然配對，是新、高效的抗體篩選方法之一。特別是在快速應(yīng)對病原微生物傳染病的抗體開發(fā)上有著巨大優(yōu)勢。

使用單個B細胞技術(shù)制備兔單克隆抗體其流程主要包括三個重要步驟：鑒定和分離單個B細胞、擴增和克隆抗體基因、重組抗體的表達與鑒定以及抗體的擴大培養(yǎng)和純化。普健生物Xten?Mab Single B 兔單克隆抗體制備無需兔骨髓瘤細胞商業(yè)化授權(quán)，采用獨特的細胞分選和富集技術(shù)，實現(xiàn)了單B細胞平臺從特異性到功能性的篩選、并保證Assay結(jié)果的準確度，提高總體篩選的工作效率、減少下游表達驗證的工作量、縮短抗體發(fā)現(xiàn)的周期，為抗體藥開發(fā)節(jié)省了寶貴的時間

Xten? Mab Single B 兔單克隆抗體開發(fā)流程 

鑒定和分離單個B細胞

單個B細胞的分離通常有隨機分離和抗原特異性分離兩種。免疫兔子后獲得抗原特異性抗體濃度較高的血樣，從中分離B細胞，操作簡單。方法主要有顯微操作、激光捕獲顯微切、熒光激活細胞分選法。還有一種適合于抗腫瘤抗體、自身免疫抗體等特異性抗體含量較低的抗原特異性分離方法，該方法需分離抗原特異性B細胞，方法包括：熒光標記抗原多參數(shù)細胞分、抗原標記磁珠分選法、微雕法、以及細胞微陣列芯片等。

擴增和克隆抗體基因

細胞分選時，通常需將單個B細胞分至內(nèi)含適量細胞裂解液、RNA 酶抑制劑和PCR反應(yīng)試劑的適當容器中進行B細胞培養(yǎng)，然后對分泌抗體檢測陽性的孔進行進RNA提取逆轉(zhuǎn)錄。通常采用合適的引物進行巢式或半巢式逆轉(zhuǎn)錄 PCR (Nested or semi-nested RT-PCR)擴增抗體可變序列。

表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體

鑒定抗體的抗原特異性和生物活性前需將攜帶有抗體基因的表達載體在相應(yīng)系統(tǒng)中表達，如原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)。通過親和層析和離子交換層析純化到的抗體，也可通過免疫沉淀、控斑法、空斑減少中和測定法流式分析法、活細胞成像測定法、體內(nèi)藥物活性測定法等方法進一步測定抗體與抗原的特異性、親和力以及中和活性保護活性等生物學(xué)特性。

單個B細胞技術(shù)由于可以直接獲得重輕鏈正確配對的抗體序列，變得越來越有吸引力，某些方面具有不可替代的優(yōu)勢。但是由于該技術(shù)對設(shè)備的高度依賴性，并且對抗原標記、引物設(shè)計的高效性和準確性方面有較高要求，對實驗人員技術(shù)要求較高。新型的Single B 兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù)平臺利用B細胞分選富集策略，在流式分選設(shè)備的支持下，有效富集抗原特異性B細胞，提高B細胞體外培養(yǎng)的成活率，保留B細胞的多樣性，可開發(fā)出不同應(yīng)用需求的抗體，且具有獨特優(yōu)勢。

高特異性：與小鼠和其他嚙齒動物相比，兔免疫系統(tǒng)更優(yōu)，產(chǎn)生的抗體特異性更強，親和力更高

高穩(wěn)定性：與常規(guī)小鼠生產(chǎn)的單克隆抗體相比，兔IgG結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高

高親和力：兔的B細胞成熟過程產(chǎn)生的親和力是嚙齒動物的10-100倍

高多樣性：兔擁有豐富的B細胞反應(yīng)庫，其產(chǎn)生的抗體在表位變異、突變、構(gòu)象變化等方面優(yōu)勢，且多樣性高