中央代謝通路的進(jìn)行過程通常被認(rèn)為是具有確定性的，但細(xì)胞是處于動(dòng)態(tài)平衡中的自催化和隨機(jī)系統(tǒng)。因此，代謝網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì)及其與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和其它細(xì)胞過程的相互作用本質(zhì)上是隨機(jī)的，這可能導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的動(dòng)態(tài)波動(dòng)。這些波動(dòng)可能會(huì)對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)可靠地執(zhí)行其功能產(chǎn)生影響，但也可能會(huì)導(dǎo)致群體中細(xì)胞之間的有益變化。動(dòng)態(tài)波動(dòng)既可以在基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生，又可能在翻譯后水平產(chǎn)生。
盡管微生物中基因轉(zhuǎn)錄隨機(jī)性的起源和結(jié)果已經(jīng)被廣泛研究，但翻譯后水平產(chǎn)生的隨機(jī)波動(dòng)的過程和重要性仍然是未知的。另外，盡管生物代謝網(wǎng)絡(luò)與生物體各項(xiàng)生命活動(dòng)息息相關(guān)，但由于檢測(cè)手段的敏感性低以及欠缺可操作性等原因，在單細(xì)胞層次實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的濃度變化一直難以實(shí)現(xiàn)，尤其是在微小的細(xì)菌細(xì)胞中。然而，基于熒光讀數(shù)的生物傳感器的開發(fā)，例如熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞代謝過程的定量監(jiān)測(cè)。
2023年4月15日，山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室畢雙玉教授與德國(guó)馬克斯普朗克陸地微生物研究所 Victor Sourjik 教授合作，在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：Dynamic fluctuations in a bacterial metabolic network 的研究論文。
該項(xiàng)研究基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)搭建了可以在單細(xì)胞水平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物濃度的顯微鏡成像系統(tǒng)，使用熒光蛋白標(biāo)記的FRET傳感器，跟蹤單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物丙酮酸在時(shí)間分辨尺度下的濃度變化動(dòng)力學(xué)。
研究團(tuán)隊(duì)通過計(jì)算機(jī)模擬和實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)饑餓的大腸桿菌細(xì)胞暴露于葡萄糖或其它幾種糖酵解碳源時(shí)，單個(gè)細(xì)胞中丙酮酸的胞內(nèi)水平在大約100秒的時(shí)間尺度上表現(xiàn)出大的周期性波動(dòng)，這些代謝波動(dòng)取決于丙酮酸轉(zhuǎn)化所涉及的生物化學(xué)反應(yīng)，并且糖酵解的動(dòng)態(tài)波動(dòng)會(huì)傳遞到其它細(xì)胞過程，導(dǎo)致群體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)的時(shí)空異質(zhì)性。
研究團(tuán)隊(duì)首先構(gòu)建了一個(gè)由4種代謝物和6個(gè)代謝反應(yīng)組成的簡(jiǎn)化的代謝動(dòng)力學(xué)模型。將糖酵解通量固定為一個(gè)恒定值，并對(duì)所有模型參數(shù)，包括大速率和結(jié)合常數(shù)隨機(jī)采樣使模型處于穩(wěn)態(tài)，再通過改變葡萄糖攝取速率來擾動(dòng)這個(gè)穩(wěn)態(tài)，并分析這種擾動(dòng)是否會(huì)導(dǎo)致糖酵解通路終產(chǎn)物丙酮酸濃度的振蕩波動(dòng)。模型預(yù)測(cè)顯示，大腸桿菌糖酵解通路可以在幾分鐘的時(shí)間尺度上產(chǎn)生代謝物的周期振蕩波動(dòng)，并且在很大的參數(shù)范圍內(nèi)都可以產(chǎn)生這種振蕩。
接下來，研究團(tuán)隊(duì)使用FRET顯微鏡成像系統(tǒng)及丙酮酸傳感器，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)FRET信號(hào)捕捉大腸桿菌群體以及單細(xì)胞內(nèi)丙酮酸水平的動(dòng)態(tài)變化過程。表達(dá)了該傳感器的大腸桿菌可以對(duì)外界丙酮酸、葡萄糖以及其它糖酵解碳源的添加做出響應(yīng)，在數(shù)秒內(nèi)觀察到胞內(nèi)丙酮酸水平的增加。更有趣的是，當(dāng)添加微摩爾濃度的葡萄糖時(shí)，大多數(shù)單細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸水平在碳源初始刺激后的1000秒以上，表現(xiàn)出持續(xù)且強(qiáng)烈的振蕩波動(dòng)，時(shí)間尺度是幾分鐘。這種持續(xù)的振蕩只在低濃度葡萄糖（10-100 μM）刺激下有所體現(xiàn)。單細(xì)胞FRET比值的功率譜密度（PSD）分析顯示，當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞暴露于高濃度葡萄糖時(shí)，在整個(gè)頻率范圍內(nèi)沒有的波動(dòng)，而對(duì)于暴露于低濃度葡萄糖的細(xì)胞，在低頻率下的PSD明顯高于背景噪聲，這與其FRET比值在幾分鐘時(shí)間尺度上的大幅振蕩波動(dòng)一致，并通過自相關(guān)性分析顯示出明顯的振蕩周期性。
另外，當(dāng)受到果糖刺激時(shí)，大腸桿菌單細(xì)胞的丙酮酸振蕩僅略弱于葡萄糖誘導(dǎo)的振蕩；甘油醛-3-磷酸能夠引起較弱的波動(dòng)，而2-磷酸甘油酸僅能引起微弱的低頻波動(dòng)；當(dāng)添加磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸以及醋酸時(shí)都不會(huì)產(chǎn)生波動(dòng)。作者進(jìn)一步研究了丙酮酸振蕩對(duì)糖酵解途徑中相關(guān)酶的依賴性，發(fā)現(xiàn)pykF缺失可以增加單個(gè)細(xì)胞中FRET信號(hào)的周期性振蕩。而當(dāng)pykA、 ppc單獨(dú)或共同與pykF敲除時(shí)極大降低了丙酮酸的振蕩。此外，丙酮酸的振蕩波動(dòng)可由于丙酮酸脫氫酶復(fù)合體組分之一aceF的缺失而消失。因此，丙酮酸振蕩取決于丙酮酸轉(zhuǎn)化所涉及的多個(gè)生物化學(xué)反應(yīng)，這與計(jì)算模型相符。
研究團(tuán)隊(duì)還研究了大腸桿菌丙酮酸振蕩波動(dòng)與其它細(xì)胞過程的相關(guān)性。利用EIIA-CFP/MglA-YFP的FRET熒光蛋白，通過追蹤單細(xì)胞FRET的變化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖刺激下單細(xì)胞內(nèi)磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（PTS）的磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)也產(chǎn)生了動(dòng)態(tài)波動(dòng)，且頻率范圍與丙酮酸波動(dòng)相似。另外，通過測(cè)量自發(fā)熒光分析大腸桿菌胞內(nèi)NAD(P)H的波動(dòng)顯示，添加葡萄糖可快速增加胞內(nèi)NAD(P)H水平，并且單細(xì)胞的NAD(P)H也產(chǎn)生了動(dòng)態(tài)波動(dòng)，其頻率范圍與丙酮酸波動(dòng)相似。因此，丙酮酸振蕩至少部分與PTS蛋白磷酸化狀態(tài)及NAD(P)H的波動(dòng)相耦合。
綜上所述，由于代謝驅(qū)動(dòng)所有的細(xì)胞過程，代謝途徑的波動(dòng)和不穩(wěn)定性可以對(duì)細(xì)胞生理產(chǎn)生影響。在葡萄糖等碳源的刺激下，大腸桿菌單細(xì)胞丙酮酸水平在幾分鐘的時(shí)間尺度上表現(xiàn)出很大的振蕩波動(dòng)。這個(gè)時(shí)間尺度比基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)短得多，因此觀察到的振蕩波動(dòng)來自于代謝網(wǎng)絡(luò)翻譯后水平的動(dòng)態(tài)變化。而丙酮酸轉(zhuǎn)化過程中的酶和生化反應(yīng)是振蕩波動(dòng)的主要來源。另外，考慮到糖酵解中間代謝物的多種調(diào)節(jié)功能，包括與丙酮酸波動(dòng)相耦合的NAD(P)H和PTS，丙酮酸振蕩可能對(duì)細(xì)菌生理產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室畢雙玉教授為論文第一作者，德國(guó)馬克斯普朗克陸地微生物研究所Victor Sourjik教授為通訊作者，德國(guó)圖賓根大學(xué)Hannes links教授也參與了該項(xiàng)研究。
