兒童克羅恩病的成功飲食治療與細菌生態(tài)失調和炎癥代謝型向健康對照的轉變有關

克羅恩病排除飲食+部分腸內營養(yǎng)(CDED+PEN)或完全腸內營養(yǎng)(EEN)的治療可緩解輕度至中度兒童克羅恩病(CD)并減少炎癥反應。本研究旨在評估營養(yǎng)治療是否可以通過調節(jié)菌群組成和功能失調從而得到緩解。評估了54例營養(yǎng)治療(CDED+PEN或EEN)后兒童CD患者得到緩解的糞便宏基因組序列、短鏈脂肪酸(SCFA)和膽汁酸(BA)，并與26例健康兒童進行了比較。飲食療法降低CD患兒變形菌門的相對豐度，增加了厚壁菌門的豐度。CD患兒有M1和M2兩種代謝型，而健康兒童僅有M1代謝型。M1的特征為擬桿菌門和厚壁菌門豐度增加、變形菌門豐度減少、短鏈脂肪酸合成途徑增加，而M2的特征為變形菌門豐度增加、SCFA降解相關基因富集。M1占比在飲食治療期間增加：46%、63%和74%(分別在第0周、6周、12周)。12周后，變形菌門的菌屬(除E. coli外)恢復至健康對照水平。盡管SCFA合成途徑增加，但癥狀緩解效果與SCFAs增加無關。初級BA在CDED+PEN組沒有變化，但在EEN組降低。綜上所述，飲食療法成功地調節(jié)了菌群組成和功能失調。然而，12周的飲食不足以完全恢復失調。我們的數(shù)據(jù)表明菌群組成和代謝型很重要，并在飲食干預的早期臨床反應中迅速變化。因此，糾正生態(tài)失調可能是未來CD治療的重要目標。  

結果

從74名患者中的54名患者獲得了完整的宏基因組序列(臨床緩解)，41名參與者在三個時間點均得到可用數(shù)據(jù)(CDED+PEN：n=23，EEN：n=18)。由于樣本可用性，我們分析了53例患者(151個樣本)的SCFA數(shù)據(jù)和42例患者(93個樣本)的BAs數(shù)據(jù)。兩組在年齡、性別、疾病部位、病程、疾病活動度、C-反應蛋白(CRP)或藥物使用方面的基線特征無統(tǒng)計學差異。

1 微生物組隨著飲食引起的緩解而改變

1.1 0-6周:變形菌減少

根據(jù)宏基因組的分類學數(shù)據(jù)，基于Bray-Curtis距離的差異性檢驗顯示，在基線和第12周之間兩種飲食方式使得患者菌群組成向健康組轉變(Permanova p=0.001)。通過LEfSe分析更詳細地識別了這些菌群變化，確定了處理組和健康對照組之間的差異菌群。與健康組相比，基線期CD患兒腸道中變形菌門

總體而言，從第0周到第6周，兩種飲食療法都減少了變形菌門豐度，增加了厚壁菌門豐度。盡管在第6周通過飲食治療達到臨床緩解時變形菌門的豐度下降，但與健康對照組相比仍有所增加。與健康對照相比，基線期患者腸道中E. coli相對豐度尤其引人注目(Wilcoxon BH校正，p=0.0005)。

由于分析是基于成分數(shù)據(jù)，對其它類群增加和/或減少可能比較敏感，我們通過對數(shù)比來檢驗與協(xié)變量相關的差異豐度，并通過Qurro進行可視化。以Bacteroidetes作為參考組，因為它在樣本和時間點之間一致。第6周時，CDED+PEN飲食患兒腸道中厚壁菌門總體上沒有增加(p>0.05)。然而，變形菌門豐度在前6周內下降(p=0.02)，主要由γ-變形菌(0周vs 6周，p=0.073)驅動，即來自Escherichia屬。有趣的是，在前6周，EEN飲食患兒腸道中厚壁菌門和變形菌門的豐度變化并不明顯(p>0.05)。在門水平上的ALDEx2成分分析發(fā)現(xiàn)，在第0周和第6周，變形菌門豐度在兩種飲食療法與健康對照組之

1.2 第6-12周:變形菌進一步減少

在第6周和第12周之間繼續(xù)使用CDED+PEN飲食治療使得變形菌門豐度進一步減少，并接近健康對照組。然而，在CD患者腸道中Proteobacteria屬Escherichia和Sutterella含量仍然比較豐富，并與健康樣本存在差異(Wilcoxon p<0.05，LDA>2)。值得注意的是，與其它Proteobacteria屬相比，炎癥狀態(tài)下基線期Escherichia的相對豐度要高得多。在增加的厚壁菌門中，患者腸道中Faecalibacterium和Blautia含量增加，但仍與健康對照組有差異。在第12周時，與CDED+PEN飲食相比，健康組樣本中的Anaerostipes、Ruminococcus、bacilli、Porphyromonadaceae、Bifidobacteriales、Ascomycota和Caudovirales的豐度更高。

在EEN飲食后的第6周和第12周之間逐漸恢復正常飲食導致變形菌門(即Enterobacter)豐度增加，并與健康對照組有明顯差異。厚壁菌門中的Streptococcus、Blautia和Faecalibacterium的豐度隨著恢復正常飲食而增加，而Peptostreptococacceae、Eubacterium、Anaerostipes、Coprococcus和Ruminococcus仍然在健康對照組中比較豐富。

對CDED+PEN組樣本進行Songbird成分分析，再次發(fā)現(xiàn)除Oscillospiraceae外(0周vs 12周，p=0.03)，厚壁菌門豐度沒有發(fā)生變化(6周 vs 12周，0周 vs 12周)，在門水平上，變形菌門豐度在第6周和第12周時持續(xù)減少，并與基線相比下降(6周 vs 12周，p=0.16；0周 vs 12周，p<0.01)。這一結果主要由Escherichia-γ變形菌豐度下降導致(p<0.01)。在該分析的所有時間點，EEN飲食引起菌群豐度變化均不( p>0.05)。門水平的ALDEx2分析發(fā)現(xiàn)，EEN樣本中變形菌豐度在第12周時與健康對照組相比存在差異。然而，第12周時CDED+PEN樣本與健康對照組間沒有差異。

2 微生物組代謝型

為了超越單獨的酶/代謝物的關聯(lián)研究，我們使用無監(jiān)督貝葉斯群落代謝分析方法(BiomeNet)來確定與健康、疾病和實現(xiàn)緩解相關的微生物代謝型。在無監(jiān)督分析中，將健康對照組與所有CD患者進行比較，發(fā)現(xiàn)患者樣本分為兩種代謝類型(M1和M2)。所有健康對照組均以后驗概率(PP)>0.9歸類于代謝型M1。CD患者同時具有M1和M2兩種代謝型，其混合類型與治療階段有關。隨著飲食治療進行，得到臨床緩解CD患者的M1比例不斷增加，從治療前的48%增加到第6周的63%和第12周的74%，并且混合權重的變化是的[配對Wilcoxon檢驗；基線 vs 第6周(p=0.03)；基線vs第12周(p<0.01)；第6周 vs 第12周(p<0.01)]。

19個主要的反應亞網(wǎng)絡對M1和M2有不同的影響。在代謝型確定的通路中，有1個反應子網(wǎng)絡在兩種代謝型之間存在差異，涉及多種糖代謝的反應，特別是被磷酸轉移酶修飾的反應。

利用16S rRNA基因數(shù)據(jù)中鑒定的分類群，對M1代謝型樣本通過BioMiCo分析鑒定的群落結構進行Cytoscape可視化。節(jié)點代表分析中識別的優(yōu)勢分類群，其大小表示這些分類群在組合中的貢獻的總后驗概率。邊表示在一個組合中同時出現(xiàn)的分類群。

利用16S rRNA基因數(shù)據(jù)中識別的分類群，對M2代謝型樣本通過BioMiCo分析鑒定的群落結構進行Cytoscape可視化。節(jié)點代表分析中識別的優(yōu)勢分類群，其大小表示這些分類群在組合中的貢獻的總后驗概率。邊表示在一個組合中同時出現(xiàn)的分類群。

3 短鏈脂肪酸

在第0周時，CDED+PEN和EEN組之間的SCFAs沒有差異。糞便SCFA濃度在CDED+PEN組的三個時間點沒有變化(p>0.05)。與基線相比，EEN飲食達到緩解的患者腸道中總SCFA濃度以及乙酸、丙酸和丁酸含量在第6周下降(Welch's t檢驗分別為p<0.01，p<0.01，p=0.02，p<0.01)，攝入其他食物后，在第6周和第12周相比其含量增加(分別為p=0.01，p=0.02，p=0.11，p<0.01)。在第6周得到緩解的CDED+PEN組和EEN組的總SCFA、乙酸、丙酸和丁酸存在差異(p<0.01，p<0.01，p=0.02，p<0.01)，但這些差異在第12周時消失。

SCFA濃度也與患者的M1、M2代謝型相關。M1與較高濃度的丁酸(p=0.02)和戊酸(p<0.001)相關。參與丁酸合成的基因也與M1和M2相關。以90% PP為臨界值發(fā)現(xiàn)，M1中增加的基因包括丁酸激酶(K009290)、磷酸丁酰轉移酶(K00634)、4-羥基丁?；?/span>-CoA脫水酶(K14534)和β-賴氨酸5,6-氨基變位酶(K01844)減少的基因包括L-谷氨酸降解為丁酸和烯酰基-CoA水合酶的基因