DNA甲基化揭示應(yīng)激反應(yīng)影響嬰兒免疫相關(guān)基因表觀遺傳

如何應(yīng)對(duì)壓力與其健康狀況息息相關(guān)。據(jù)推測(cè)，早期應(yīng)激反應(yīng)有助于促進(jìn)發(fā)育機(jī)體健康，但應(yīng)激反應(yīng)與發(fā)育過(guò)程中早期免疫功能之間的關(guān)系尚不清楚。本研究首先假設(shè)應(yīng)激反應(yīng)可能影響嬰兒期免疫基因的表觀遺傳調(diào)控，為此，作者研究了154只恒河猴仔猴（3-4個(gè)月大）的行為反應(yīng)和下丘腦-垂體-腎上腺應(yīng)激反應(yīng)是否與表觀基因組免疫細(xì)胞DNA甲基化模式相關(guān)。在標(biāo)準(zhǔn)化的生物行為評(píng)估過(guò)程中收集仔猴的行為和生理反應(yīng)，包括臨時(shí)遷移及與猴媽媽和社會(huì)群體分離。利用簡(jiǎn)化基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）從分離后2小時(shí)內(nèi)收集的血液DNA進(jìn)行全基因組DNA甲基化定量分析。通過(guò)簡(jiǎn)單回歸、控制免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)的多元回歸和置換回歸（permutation regression）進(jìn)行表觀基因組分析（均校正錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）。在分析的變量中鑒定出20368個(gè)特異性位點(diǎn)（在9040個(gè)基因中）甲基化與三種分析中的至少一種行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇檢測(cè)相關(guān)。免疫系統(tǒng)過(guò)程本體（ontology）類(lèi)別中的442個(gè)基因與趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)基因通路介導(dǎo)的炎癥中94個(gè)基因存在關(guān)聯(lián)。在用于進(jìn)一步研究的35個(gè)候選基因中，有13個(gè)基因具有至少一個(gè)甲基化與行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇相關(guān)的位點(diǎn)，包括糖皮質(zhì)激素受體基因中的兩個(gè)內(nèi)含子位點(diǎn)。在社會(huì)分離后，甲基化與第二天情緒行為（第2天情緒，β=?0.39，q<0.001）和皮質(zhì)醇反應(yīng)（樣本1；β=?0.33，q<0.001）呈負(fù)相關(guān)。總之結(jié)果表明，生物行為應(yīng)激反應(yīng)可能與表觀基因組發(fā)育有關(guān)，免疫細(xì)胞DNA甲基化可能是應(yīng)激反應(yīng)模式影響健康和免疫功能的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。

研究亮點(diǎn)：

全基因組20000多個(gè)位點(diǎn)的甲基化與生物行為檢測(cè)相關(guān)。

多種免疫相關(guān)基因甲基化可預(yù)測(cè)生物行為應(yīng)激反應(yīng)。

在非免疫通路中發(fā)現(xiàn)許多甲基化-生物行為學(xué)相關(guān)聯(lián)。

研究結(jié)果

（1）免疫系統(tǒng)過(guò)程和炎癥通路基因研究

該表顯示免疫系統(tǒng)過(guò)程注釋類(lèi)別（PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)）中與簡(jiǎn)單線(xiàn)性回歸、免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)的多元回歸控制和置換回歸中的行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇相關(guān)位點(diǎn)匯總，僅顯示啟動(dòng)子附近區(qū)域位點(diǎn)。

該圖顯示了免疫系統(tǒng)過(guò)程中的生物過(guò)程注釋類(lèi)別和趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥中與轉(zhuǎn)錄功能相關(guān)的基因組區(qū)域中三個(gè)選定位點(diǎn)的原始數(shù)據(jù)，β值表示所示自變量和因變量之間關(guān)聯(lián)的簡(jiǎn)單回歸的β權(quán)重?？s寫(xiě)：D1 Emo表示第1天情緒；HI Act表示人類(lèi)入侵者活動(dòng)；HI Agg表示人類(lèi)入侵者攻擊；Samp3表示皮質(zhì)醇樣品3（分離后23.5小時(shí)，地塞米松后16.5小時(shí)）；Samp1表示皮質(zhì)醇樣品1（分離后2小時(shí)）。

僅顯示5‘UTR、3’UTR和啟動(dòng)子附近及下游區(qū)域的位點(diǎn)（啟動(dòng)子200、啟動(dòng)子1500、下游200、下游1500）

（2）PANTHER過(guò)表達(dá)分析

縮寫(xiě)：D1 Emo和D2 Emo表示第1天和第2天情緒；HI Agg表示人類(lèi)入侵者攻擊；HI-Disp表示人類(lèi)入侵者遷移；HI Emo表示人類(lèi)入侵者情緒；Eosin表示嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

該表顯示了在簡(jiǎn)單回歸、免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)的多元回歸控制和分析的每個(gè)自變量的置換回歸中的全基因組位點(diǎn)的過(guò)表達(dá)分析匯總。僅顯示了相對(duì)于恒河猴參考基因組和分析的位點(diǎn)子集過(guò)表達(dá)通路。Pathway列表示過(guò)表達(dá)的PANTHER基因通路。IV列表示該通路在與特定自變量相關(guān)位點(diǎn)中過(guò)表達(dá)。Number of Sig. Genes in Pathway列表示具有至少一個(gè)在該位點(diǎn)甲基化與所示自變量相關(guān)位點(diǎn)的特異性基因數(shù)量。Total in Pathway列表示在分析的數(shù)據(jù)中（或括號(hào)中的恒河猴參考基因組中）該通路中有多少基因。Expected in Pathway列表示通路中偶然預(yù)期命中的基因數(shù)量。Fold Enrichment表示通路中觀察到的命中的數(shù)量超過(guò)預(yù)期基因數(shù)的程度。并非所有有意義的位點(diǎn)都在PANTHER基因通路中進(jìn)行了注釋?zhuān)?/span>Attained Sig列中顯示的數(shù)字對(duì)應(yīng)于基因通路中注釋的重要位點(diǎn)數(shù)量。FDR q列表示二項(xiàng)式比例檢驗(yàn)的過(guò)表達(dá)p值，并根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率進(jìn)行校正。

其中甲基化與第1天情緒相關(guān)。β值表示所示自變量和因變量之間關(guān)聯(lián)的簡(jiǎn)單回歸β權(quán)重。

（3）特定候選基因研究

（4）免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)分析

結(jié)論：

本研究通過(guò)RRBS等實(shí)驗(yàn)在恒河猴表觀基因組中鑒定出20368個(gè)與應(yīng)激狀態(tài)的行為或生理反應(yīng)相關(guān)的特異性位點(diǎn)。研究結(jié)果表明，應(yīng)激反應(yīng)與免疫系統(tǒng)功能和炎性反應(yīng)的表觀遺傳調(diào)控相關(guān)聯(lián)。本研究為人類(lèi)和恒河猴的甲基化-氣質(zhì)關(guān)聯(lián)的表觀基因組研究提供了有利證據(jù)。作者推測(cè)，早期生活應(yīng)激反應(yīng)的個(gè)體差異可能會(huì)對(duì)免疫表觀基因組產(chǎn)生編程效應(yīng)，從而影響后期的健康結(jié)果。需要繼續(xù)研究以探索這些表觀遺傳特征是如何在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)，以及其在個(gè)體健康和疾病差異中的作用。

關(guān)于易基因簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序研究解決方案

簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，富集啟動(dòng)子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進(jìn)行重亞硫酸鹽測(cè)序。該技術(shù)提高了高CpG區(qū)域的測(cè)序深度，在CpG島、啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

為適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點(diǎn)的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。

為助力適用低起始量DNA樣本（5ng）量多維度甲基化分析，易基因開(kāi)發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化靶向基因組測(cè)序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和微量樣本復(fù)用檢測(cè)，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個(gè)細(xì)胞基因組CG位點(diǎn)覆蓋高達(dá)15M以上。