不同腫瘤中癌細胞狀態(tài)的復(fù)發(fā)及其與腫瘤微環(huán)境的相互作用

研究背景

腫瘤中轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和治療失敗的主要因素。通過scRNA-seq技術(shù)已實現(xiàn)對單個腫瘤細胞的無偏見轉(zhuǎn)錄組分析，并揭示了同一腫瘤組織惡性細胞之間的異質(zhì)性，這種轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性被組織成癌細胞狀態(tài)。先前的研究結(jié)果表明存在與應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)和缺氧相關(guān)的癌細胞狀態(tài)，且癌細胞狀態(tài)與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中特定細胞類型存在因果關(guān)系。然而，尚不清楚癌細胞狀態(tài)在多大程度上跨越了腫瘤類型，是否構(gòu)成癌癥的一般特征以及癌細胞狀態(tài)與TME是否存在相互作用。因此，需要比較不同的腫瘤類型來尋找腫瘤異質(zhì)性的共同點，并系統(tǒng)地研究癌細胞狀態(tài)和TME中非癌細胞類型之間的關(guān)系。

研究策略

研究人員對收集的19例未治療患者的新鮮原發(fā)腫瘤組織進行scRNA-seq，并且收集了公共數(shù)據(jù)庫的腫瘤單細胞轉(zhuǎn)錄組樣本。共涉及15種癌癥類型，包括卵巢癌（ovary carcinoma，OVCA）、子宮內(nèi)膜癌（endometrium carcinoma，UCEC）、乳腺癌（breast carcinoma，BRCA）、前列腺癌（prostate carcinoma，PRAD）、腎癌（kidney carcinoma， KIRC）、肝癌（liver carcinoma，LIHC）、結(jié)腸癌（colon carcinoma，COAD）、胰腺癌（pancreas carcinoma，PDAC）、胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）、膽管癌（cholangiocarcinoma，CHCA）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、皮膚鱗狀細胞癌（skin squamous cell carcinoma，SKSC）、膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）和少突膠質(zhì)細胞瘤（oligodendroglioma，OGD），如圖1a。基于這15種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)，研究人員定義了一系列在多個癌癥類型中共享的基因模塊，并基于基因模塊量化了每個惡性細胞的細胞狀態(tài)。隨后，對收集的10例未治療患者的新鮮原發(fā)腫瘤組織（OVCA∶UCEC∶BRCA∶PDAC∶GIST∶LIHC=2∶1∶3∶1∶2∶1）進行空間轉(zhuǎn)錄組測序，以探究特定癌細胞狀態(tài)附近的細胞類型分布。通過小鼠模型，研究人員進一步驗證干擾素的癌細胞狀態(tài)會隨著附近淋巴細胞的減少而減弱。

研究成果

1. 不同類型癌癥的單細胞圖譜

研究人員首先探究了收集的19例腫瘤組織的單細胞圖譜。為了區(qū)分惡性細胞與非惡性細胞，研究人員借助文獻檢索獲得的細胞類型標志基因及singleR軟件進行細胞類型注釋，結(jié)果顯示，細胞主要被注釋為上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、髓樣細胞、B細胞、T細胞以及自然殺傷細胞。而后，進一步對惡性細胞進行識別：第一，借助文獻檢索獲得的特定腫瘤細胞標志基因識別惡性細胞；第二，依據(jù)惡性細胞通常具有異常的拷貝數(shù)狀態(tài)來進一步驗證識別的惡性細胞；第三，根據(jù)腫瘤間異質(zhì)性對來自不同腫瘤的假定惡性細胞進行降維，以驗證它們是否形成單獨的簇。

為了擴展研究的癌癥類型范圍，研究人員進一步收集了公共數(shù)據(jù)庫的腫瘤單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并同樣進行細胞類型的注釋及惡性細胞的識別。

2. 不同癌癥類型間重復(fù)出現(xiàn)的基因模塊

基于基因模塊定義細胞狀態(tài)，不僅可以通過組合模塊更加靈活復(fù)雜地表征細胞狀態(tài)，同時還能減少樣本和研究中技術(shù)差異的影響。為此，研究人員基于非負矩陣分解對每個樣本的惡性細胞進行分析，確定共表達基因集的基因模塊。隨后，鑒別不同腫瘤類型間重疊的模塊，并通過GO通路以及已知細胞類型的標志基因進行模塊注釋。共確定16個多癌種共享的基因模塊，每個模塊由9到297個協(xié)同表達的基因組成。研究人員發(fā)現(xiàn)一些模塊在多種不同器官系統(tǒng)的癌癥中被廣泛檢測到，包括細胞周期（cycle）、應(yīng)激反應(yīng)（stress）、干擾素反應(yīng)（interferon）、缺氧（hypoxia）、氧化磷酸化（oxphos），以及金屬硫蛋白反應(yīng)（me[x]tal），這些模塊主要涉及細胞特定的生物學(xué)過程和反應(yīng)。而另一些模塊則顯示器官系統(tǒng)特異性，比如肺泡模塊（alveolar）、纖毛相關(guān)基因模塊（ciliated）、基底細胞模塊（basal）、鱗狀細胞模塊（squamous）、腺體模塊（glandular）、星形膠質(zhì)細胞（astrocyte，AC）樣模塊、少突膠質(zhì)細胞（oligodendrocyte progenitor cell，OPC）樣模塊和神經(jīng)祖細胞（neural progenitor cell，NPC）樣模塊。此外，還包括2個與上皮細胞間質(zhì)化相關(guān)的模塊，即在HNSC、SKSC和GBM中存在的部分間質(zhì)模塊（partial mesenchymal module，pEMT），以及在PDAC、CHCA、LUAD和GBM中存在的完全間質(zhì)模塊（complete mesen chymal module，cEMT）。

同時，研究人員發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)模塊在相應(yīng)器官的正常上皮細胞中也存在，盡管程度較低。這表明這些模塊并不是在癌癥中新產(chǎn)生的，而是原本存在于正常組織中，是在正常組織癌變過程中逐漸被選擇出來，并在癌癥中呈現(xiàn)出更多樣化的表達。

3. 基因模塊定義癌細胞狀態(tài)

研究人員借助基因表達可以計算每個惡性細胞的基因模塊得分，從而量化每個癌細胞狀態(tài)。簡單來說，通過1,000次隨機取樣，獲得1,000個與基因模塊同等數(shù)量的基因列表，并計算模塊基因平均表達超過這1,000個基因集平均表達的比例，從而評估每個細胞特定模塊的細胞狀態(tài)。研究人員基于惡性細胞的模塊，對19例本研究測序的單細胞數(shù)據(jù)分數(shù)進行UMAP降維，然后用每個癌細胞中得分高的模塊對細胞進行注釋。結(jié)果表明，癌細胞不再按照患者個體或癌癥類型進行聚集，而是按照其高表達的模塊來聚集。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)有些模塊呈現(xiàn)共表達，如pEMT與干擾素反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)模塊共表達。以上結(jié)果表明，基于基因模塊定義的癌細胞狀態(tài)通常不代表特定的腫瘤實體。

由于一些模塊也存在于正常組織中，因而研究人員比較了正常組織和癌組織中表達每個模塊的細胞比例，以分數(shù)大于0.5視為模塊表達。在所有癌癥類型中，pEMT模塊在所有癌癥類型中表達的比例都大于其正常組織，這與腫瘤進展中經(jīng)常發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化相一致。由于正常肺組織和皮膚都具有鱗狀細胞，因此研究人員沒有觀察到LUAD、SKSC與其正常組織間鱗狀細胞模塊的細胞比例差異。與之相反的是，PDAC中鱗狀細胞模塊的細胞比例升高，而其正常胰腺組織通常以導(dǎo)管細胞為主，表明PDAC癌細胞可能發(fā)生了鱗狀分化。此外，與正常皮膚組織相比，SKSC中腺體模塊的細胞比例上升。這些變化都表明，癌癥組織中既保留了正常組織的模塊，又隨著疾病進展而表現(xiàn)出其他細胞類型的模塊。

4.  癌細胞狀態(tài)與TME的相互作用

為了探究癌細胞狀態(tài)與TME中細胞類型的關(guān)系，研究人員開展了空間轉(zhuǎn)錄組測序。由于空間轉(zhuǎn)錄組中spot并不是單細胞分辨率，因此通過非負線性小二乘回歸方法以及單細胞數(shù)據(jù)作為參考將spot分為三個部分：僅包含惡性細胞，即“Malignant”；包含免疫細胞和基質(zhì)細胞，即“Normal”；前兩者重疊的spot，即“Both”。研究人員首先探究了“Normal”和“Both”spot的細胞類型組成，以了解在惡性細胞存在時細胞組成是如何變化的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在包含惡性細胞的spot中內(nèi)皮細胞比例降低，表明腫瘤中不充分的血管生成。相反，中性粒細胞的比例升高。進一步研究人員還分析了抗腫瘤的M1和促腫瘤的M2巨噬細胞的比例，發(fā)現(xiàn)M1/M2比值在“Both”spot中高于“Normal”spot。這兩個現(xiàn)象表明，在癌細胞附近具有強大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 

接下來，研究人員嘗試探究特定癌細胞狀態(tài)與TME的相互作用。為此，研究人員計算每個“Malignant”spot的模塊得分，并通過“neighborhood score”和“proximity score”兩個指標來評估特定癌細胞狀態(tài)和周圍TME中細胞組成的關(guān)系。其中“neighborhood score”表示特定癌細胞狀態(tài)的spot在其鄰近區(qū)域內(nèi)感興趣細胞的比例；“proximity score”表示特定癌細胞狀態(tài)的spot與感興趣細胞間的距離?！?/span>Malignant”spot模塊得分與“neighborhood score”間相關(guān)性分析揭示了一些癌細胞狀態(tài)與TME特定細胞的共定位現(xiàn)象。比如在BRCA NYU2樣本中，“Malignant”spot的干擾素反應(yīng)模塊得分與該spot巨噬細胞的“neighborhood score”和“proximity score”呈正相關(guān)，表明干擾素反應(yīng)的癌細胞狀態(tài)周圍富集巨噬細胞。對所測的10個空間轉(zhuǎn)錄樣本中也可以觀察到這種關(guān)系，進一步表明這種關(guān)系的普遍性。此外，也可以觀察到其他一些相互作用，如cEMT和pEMT的癌細胞狀態(tài)與成纖維細胞、內(nèi)皮細胞的共定位，干擾素反應(yīng)的癌細胞狀態(tài)與T細胞共定位等。綜上表明，癌細胞狀態(tài)與TME的細胞組分密切相關(guān)，要么癌細胞狀態(tài)改變其周圍的細胞類型組成，要么TME中細胞類型誘導(dǎo)特定癌細胞狀態(tài)的產(chǎn)生。

5. 干擾素反應(yīng)受腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)

在腫瘤中IFNα和IFNβ由癌細胞和樹突狀細胞分泌，導(dǎo)致T細胞啟動和抗腫瘤活性。為了進一步測試干擾素反應(yīng)與TME中T細胞之間的關(guān)系，異體移植小鼠模型被使用。在該模型中，通過基因敲除可以容易干擾TME中細胞的組成。首先，研究人員在具有正常免疫系統(tǒng)的小鼠腫瘤異體移植模型中進行腫瘤組織的scRNA-seq分析，結(jié)果表明，小鼠異體移植模型可以重現(xiàn)癌癥患者腫瘤樣本中存在的5個基因模塊：細胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)、缺氧和腺體模塊。接下來，研究人員在缺乏T細胞和B細胞的Rag1-/-小鼠中進行腫瘤組織的scRNA-seq分析，結(jié)果顯示，細胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、缺氧以及腺體模塊的表達頻率在野生型和Rag1-/-小鼠異體移植模型中沒有差別；與之相反的是，干擾素反應(yīng)模塊的表達頻率在Rag1-/-小鼠異體移植模型中降低。此外，研究人員進一步發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊表達細胞的頻率也因腫瘤位置而異。這進一步通過實驗證明了干擾素反應(yīng)的癌細胞狀態(tài)與TME中的T細胞相互作用。

結(jié)論

本研究通過泛癌單細胞圖譜發(fā)現(xiàn)了不同腫瘤類型間重復(fù)出現(xiàn)的基因模塊，并基于基因模塊定義細胞狀態(tài)，從而減少樣本和研究中技術(shù)差異的影響。隨后研究發(fā)現(xiàn)模塊共表達現(xiàn)象的存在，這表明癌細胞狀態(tài)不能明確定義為細胞類型：由于模塊可能組合表達而不是相互排斥，從而導(dǎo)致細胞狀態(tài)連續(xù)變化而非形成離散簇。隨后借助空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究揭示了多種癌細胞狀態(tài)與TME中特定細胞類型的相互作用，并基于小鼠模型驗證了干擾素反應(yīng)的細胞狀態(tài)與T細胞的相互作用。總之，該研究結(jié)果為探究癌細胞狀態(tài)如何與腫瘤微環(huán)境相互作用以形成能夠免疫逃逸、耐藥性和轉(zhuǎn)移的組織系統(tǒng)提供了框架。