新研究或有助于開發(fā)靶向γ-分泌酶藥物

抑制γ-分泌酶活性策略顯示嚴(yán)重副作用

01

γ-分泌酶復(fù)合物可切割多種I型跨膜蛋白，以淀粉樣前體蛋白(APP)和Notch蛋白為例。APP被β-分泌酶切割產(chǎn)生羧基端99殘基片段，稱為APP- C99，然后被γ-分泌酶連續(xù)切割，釋放出不同長度的APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AICD)和β-淀粉樣肽(Aβ)。相對較長的Aβ容易在大腦中形成低聚物和淀粉樣斑塊。

淀粉樣斑塊的積累是AD的一個標(biāo)志。抑制γ-分泌酶活性已被用于AD的治療。然而，到目前為止，這一策略尚未顯示出益處；更糟糕的是，在臨床試驗中觀察到嚴(yán)重的副作用。副作用可能部分歸因于非特異性抑制γ-分泌酶對其他底物的切割，特別是Notch，它在發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)的決定中起著至關(guān)重要的作用。在Notch上選擇性抑制APP的γ-分泌酶切割被認(rèn)為可以減輕副作用。然而，APP和Notch以類似的方式結(jié)合γ-分泌酶，使底物選擇性γ-分泌酶抑制劑(GSIs)的設(shè)計復(fù)雜化。

MRK-560與PS1之間存在優(yōu)先關(guān)聯(lián)

02

MRK-560 是一種用于 PS1 和 PS2 的同種型選擇性抑制劑，為了驗證MRK-560的抑制作用，研究團(tuán)隊使用純化的PS1或PS2復(fù)合物重建了體外裂解測定。Aβ40（不同長度的 Aβs 中的主要裂解產(chǎn)物）和 AICD（其裂解反映了γ分泌酶的內(nèi)肽酶活性）的產(chǎn)生分別用 AlphaLISA 和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行測量。

與先前的研究一致，MRK-560顯示出對PS1復(fù)合物的更有效抑制。集成電路PS1或PS2復(fù)合物的MRK-560估計分別為33±2 nM或173±24 nM。在200 nM MRK-560存在下，PS1復(fù)合物產(chǎn)生的AICD被完全抑制。相比之下，即使在存在10μM MRK-560的情況下，PS2復(fù)合物產(chǎn)生的AICD仍然可以檢測到。

在MRK-560結(jié)合時，與無配體狀態(tài)相比，PS1經(jīng)歷了實質(zhì)性的構(gòu)象變化。與其他報告的 GSI 類似MRK-560結(jié)合誘導(dǎo)兩條β的形成和PAL環(huán)的運(yùn)動。TM6之后的胞質(zhì)序列折疊到TM6a，TM6a通過柔性連接子連接到TM6并向抑制劑結(jié)合位點彎曲。PS2M采用與apo復(fù)合物幾乎相同的構(gòu)象，缺乏抗平行β片和TM6a的延伸特征。平行結(jié)構(gòu)分析表明，與PS2相比，MRK-560與PS1之間存在優(yōu)先關(guān)聯(lián)。

接下來，研究人員檢查了結(jié)構(gòu)以確定MRK-560同種型選擇性的分子基礎(chǔ)。MRK-560與PS1的Asp385，Leu432和Leu282形成三個氫鍵（H鍵）。其中，Asp385是PS1的催化殘基之一，Leu432先于PAL基序，Leu282位于PS1的TM6a和β1之間的中間回路。MRK-560的二氟芐基（DFB）和三氟甲磺酰胺（TFMS）基團(tuán)與Val272，Thr281，Lys380，Gly382，Ala431和Pro433相互作用，氯苯基（CP）基團(tuán)與Val379，Leu381，Leu418，Thr421，Leu422和Ala434的側(cè)鏈相互作用。

為了研究這兩個殘基是否負(fù)責(zé)對MRK-560的亞型依賴性敏感性，研究人員生成了PS1和PS2變體，在這兩個位置交換了殘基，并檢查了它們對MRK-560抑制的反應(yīng)。共生成了六個變體，包括PS1中的Thr281 / Leu282與PS2中的Pro287 / Ile288的單殘差交換和雙殘留物交換。在體外裂解測定中檢查MRK-560對六種含有PS1 / PS2突變體的復(fù)合物的反應(yīng)，每種復(fù)合物純化至均一性。

03

研究表明，MRK-560會減少大腦中Aβ的產(chǎn)生。重要的是，它不會在野生型小鼠模型中誘發(fā)Notch相關(guān)的副作用。在這項工作中，研究人員測定了MRK-560處理過的PS1/PS2復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，以闡明MRK-560亞型特異性的分子基礎(chǔ)。

MRK-560占據(jù)PS1的底物結(jié)合位點，但在PS2中不可見。結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，PS1中的Thr281和Leu282是MRK-560亞型依賴性敏感性的決定因素，PS1和PS2之間的交換實驗證實了這一點。通過揭示早老素的亞型選擇性抑制機(jī)制，該研究工作可能有助于未來靶向γ-分泌酶的藥物的發(fā)現(xiàn)。