不依賴泛素蛋白酶降解途徑的新型

上述分子的體現(xiàn)了降解劑的結(jié)構(gòu)與應(yīng)用類型的豐富性，但降解劑類分子的合理設(shè)計(jì)與不斷優(yōu)化以及活性檢測(cè)仍有很長(zhǎng)的路要走。

“鐘” 模型與協(xié)同效應(yīng)

前文我們已經(jīng)介紹過(guò)，PROTAC 分子的設(shè)計(jì)之初，靶蛋白配體、E3 連接酶配體和兩者中間的連接子三者應(yīng)該分別考量。

在 PROTAC 介導(dǎo)的蛋白降解途徑中，其中靶標(biāo)配體 (POI)-PROTAC-E3 連接酶等三元復(fù)合物的有效形成同樣起到重要作用。三元復(fù)合物的任一單元的濃度改變帶來(lái)的不僅僅是線性變化，“鐘” 形模型常常被用來(lái)解釋這樣的活性與濃度相關(guān)性，文獻(xiàn)中提及的 hook effect 也正是形容這種情形。

另外，在活性研究中，協(xié)同效應(yīng) (cooperativity, α) 這一詞匯，被用于解釋 PROTAC 受 POI 與 E3 連接酶配體間蛋白蛋白相互作用 (PPI) 的影響。當(dāng) α 大于 1 時(shí)，POI 和 E3 是正協(xié)同效應(yīng)，對(duì)三元復(fù)合物的形成有利。

不依賴泛素蛋白酶的降解體系

1. 依賴溶酶體途徑的降解類分子

PROTAC 主要依賴泛素-蛋白酶體途徑，其對(duì)應(yīng)降解的大多為胞質(zhì)蛋白與核蛋白。Bertozzi 教授的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一項(xiàng)靶向胞外蛋白的降解技術(shù)——溶酶體靶向嵌合體 (LYTAC)。已證明 LYTAC 成功降解了表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)、程序性死亡配體 1 (PD-L1) 等膜上蛋白。 對(duì)于細(xì)胞中一些非蛋白成分，Targeting lipid droplets for autophagic degradation by ATTEC 一文展示了一種通過(guò)自噬束縛化合物 (ATTECs) 降解非蛋白質(zhì)生物分子的新策略，使用脂滴作為示例靶標(biāo)并成功降解。

LD·ATTECs 通過(guò)疏水作用與 LD 以及自噬體蛋白 LC3 結(jié)合，形成LD/TAG LD·ATTEC LC3三元復(fù)合物，復(fù)合物與自噬體溶酶體融合并被自噬體降解。

但不論是 PROTAC 還是上述其他方式，它們都靶向真核生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，均不能在細(xì)菌和其他原核生物中發(fā)揮功能。 

2. 依賴 ClpCP 酶的 BacPROTAC

他們基于 Clausen 實(shí)驗(yàn)室之前的一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)：在枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽(yáng)性菌中，AAA 去折疊酶 ClpC 和蛋白酶 ClpP 組成的 ClpC–ClpP (ClpCP) 蛋白酶是降解細(xì)菌中未折疊和聚集蛋白質(zhì)的重要蛋白水解酶。由于磷酸精氨酸的對(duì)接位點(diǎn)位于 ClpC ATP 酶的氨基末端結(jié)構(gòu)域，磷酸精氨酸 (pArg) 可作為 ClpCP 蛋白酶復(fù)合體的降解標(biāo)簽。

Morreale 等人報(bào)道的細(xì)菌 PROTACs (BacPROTACs) 由 POI 配體、li[x]nker 和 ClpCNTDs 配體組成，可誘導(dǎo)細(xì)菌這種沒(méi)有泛素蛋白酶體的非真核生物蛋白的體內(nèi)外降解。如圖 3A，研究團(tuán)隊(duì)在體外首先以單體鏈霉親和素 (mSA) 作為模型蛋白，通過(guò) BacPROTAC 將 pArg (ClpCNTD 配體) 與生物素 (mSA 的配體) 結(jié)合，形成 BacPROTAC-1 三元復(fù)合物，有效降解靶蛋白。BacPROTAC-1 與 mSA 和 ClpCNTD 結(jié)合的 KD 為 3.9 和 2.8 μM (如圖 3C)。

由于磷精氨酸的化學(xué)穩(wěn)定性等方面存在問(wèn)題，在體內(nèi)的應(yīng)用有限。作者團(tuán)隊(duì)將內(nèi)源性的磷酸化精氨酸殘基 (pArg) 換成了高選擇性的 sCym-1。sCym-1 不但可以和枯草芽孢桿菌的 ClpCP 結(jié)合，還可以與分歧桿菌的 ClpC1P1P2 結(jié)合。

由于細(xì)胞生物素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性與 mSA 結(jié)合，一定程度上阻礙 BacPROTAC 活性 ，作者團(tuán)隊(duì)確定以 Bromodomain-1 (BD1) 作為更吸引人的模型底物，并將 JQ1 作為新的POI配體，天然環(huán)素 dCymM  作為 ClpCNTD 結(jié)合基團(tuán)。BacPROTACs 以濃度依賴性的方式促進(jìn) BRDTBD1 的降解。

BacPROTACs 以高度特異的方式將細(xì)菌 ClpCP 蛋白酶定向到底物上，它不但可以誘導(dǎo)底物和蛋白酶之間的接近，并且通過(guò)結(jié)合誘導(dǎo)無(wú)活性的 ClpCP 十聚體重組為有活性的六聚體形式，直接啟動(dòng) ClpCP 水解靶標(biāo)蛋白。

沒(méi)有 li[x]nker 的降解劑？

在降解劑分類里，分子膠 (Molecular glues) 指同樣發(fā)揮誘導(dǎo)蛋白降解作用卻無(wú) li[x]nker 連接的一類分子，如Thalidomide、CC-92480、CC-90009 等結(jié)構(gòu)。分子膠在結(jié)構(gòu)上更接近傳統(tǒng)小分子,在膜透過(guò)性和生物利用度上更具優(yōu)勢(shì)，是 PROTAC 型降解劑的一個(gè)改造方向。

降解能力評(píng)價(jià)

降解劑的目的是降解相關(guān)的蛋白， 無(wú)論是依賴泛素酶途徑的 PROTAC，依賴蛋白酶體途徑的 LYTAC，依賴 (ClpCP) 蛋白酶的 BacPROTAC。除 Kd 值測(cè)定之外，Western Blot 實(shí)驗(yàn)在驗(yàn)證蛋白降解方面更為直觀，因此常常被用于 PROTAC 類分子活性的測(cè)試。

總結(jié)

PROTAC 已經(jīng)衍生出一類 “POI 配體-li[x]nker-降解系統(tǒng)導(dǎo)向物” 模式的分子，這類分子補(bǔ)足了 PROTAC 作為降解劑在某些蛋白與非蛋白分子降解上的不足，賦予了降解劑這一概念更多的可能性。除了分子自身作用機(jī)制帶來(lái)活性測(cè)試結(jié)果上與常規(guī)分子的差異，合適的降解途徑對(duì)活性的影響尤其巨大。

MCE 是全球前沿的科研化學(xué)品和生物活性化合物供應(yīng)商，可以為科學(xué)家提供 PROTAC 類相關(guān)產(chǎn)品，目前我們已有 PROTAC、AUTAC、ATTEC、分子膠以及它們的構(gòu)成模塊等各種產(chǎn)品在線。同時(shí)，我們還提供 PROTAC 類產(chǎn)品的一體化合成服務(wù)。

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