微生物組學(xué)和代謝組學(xué)綜合分析揭示了半干旱農(nóng)場(chǎng)土壤微生物和代謝功能對(duì)磷肥的響應(yīng)

磷的局部施肥在實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)和提高養(yǎng)分利用效率方面具有潛在的益處，但土壤微生物與相關(guān)代謝周期之間相互作用的潛在生物學(xué)機(jī)制仍有待研究。

本研究中，我們將微生物學(xué)與非靶標(biāo)代謝組學(xué)相結(jié)合，基于高通量測(cè)序和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），探索了磷肥濃度和施肥模式對(duì)小麥土壤微生物群落和代謝功能的影響。

結(jié)果表明，磷肥降低了細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS基因的多樣性，改變了土壤細(xì)菌和真菌整體群落結(jié)構(gòu)和組成。磷濃度和施肥模式也干擾了土壤細(xì)菌和真菌共生網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。

代謝組學(xué)分析表明，磷肥改變了土壤代謝物，差異代謝物富集到包括精氨酸和脯氨酸代謝、植物激素生物合成、氨基酸、植物次生代謝物、鳥氨酸衍生生物堿等在內(nèi)的7個(gè)主要代謝途徑。

此外，通過相關(guān)分析我們發(fā)現(xiàn)，微生物與代謝物的積累密切相關(guān)。

我們的結(jié)果表明，局部適當(dāng)?shù)牧追试谡{(diào)節(jié)土壤微生物代謝中起著重要作用，它們?cè)谕寥乐械南嗷プ饔脼槔斫饬坠芾韺?shí)踐的改變?nèi)绾斡绊憦?fù)雜的生物過程和植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力提供了有價(jià)值的信息。

測(cè)序序列及微生物豐度和微生物多樣性

經(jīng)過質(zhì)控過濾后，我們分別從16S rRNA和ITS基因測(cè)序中獲得1,473,243和2,486,782個(gè)有效標(biāo)簽。在97%分類水平上進(jìn)行OTU聚類后，共獲得了2,935個(gè)細(xì)菌OTUs和823個(gè)真菌OTUs。

稀疏分析顯示，細(xì)菌16S基因在1,473,243深度下趨于平緩，而真菌ITS基因在2,486,782的測(cè)序深度下趨于平緩。

在微生物群落的多樣性和豐富度方面，與對(duì)照相比，除120 kg P ha-1均勻施肥外，所有磷肥處理均增加了表層土16S rRNA樣品中所觀察到的OTUs數(shù)和Chao1指數(shù)；除60 kg P ha-1條帶施肥（小麥種子5 cm下施肥）外，所有磷肥處理均降低了下層土壤的OTUs數(shù)和Chao1指數(shù)。

在表層土壤中，僅120 kg P ha-1條帶施肥處理下土壤的Shannon指數(shù)高于對(duì)照土壤，所有施肥處理均降低了下層土壤的Shannon指數(shù)。

在表層土壤中，只有60 kg P ha-1的條帶施肥增加了OTUs的數(shù)量以及真菌的多樣性和豐富度（如Shannon和Chao1指數(shù)）；在下層土壤中，與對(duì)照組相比，所有磷肥處理均降低了多樣性和豐富度指數(shù)。

簡(jiǎn)而言之，施磷濃度和不同的施磷模式會(huì)改變土壤微生物群落的多樣性和豐富度指標(biāo)。

基于16S rRNA基因和ITS基因?qū)ν寥兰?xì)菌和真菌群落組成評(píng)估

基于PCA分析，我們?cè)u(píng)價(jià)了5個(gè)處理間微生物群落的變化。細(xì)菌和真菌群落的前兩個(gè)主成分解釋了基于OTU水平的總變異度。

這些地塊揭示了5個(gè)處理下表層土壤和下層土壤中細(xì)菌和真菌群落的明顯差異。其中每個(gè)處理的3個(gè)重復(fù)通常聚集在一起，并與其他處理分離。

沿PC1和PC2的各處理間較大的距離表明，磷肥對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于磷肥對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。 細(xì)菌序列分布于43個(gè)細(xì)菌門，209個(gè)細(xì)菌科以及471個(gè)細(xì)菌屬。

所有土壤樣品細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門（Proteobacteria，31.81%）、放線菌門（Actinobacteria，27.08%）、酸桿菌門（Acidobacteria，15.12%）、綠彎菌門（Chloroflexi，7.21%）以及芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，4.61%），這些細(xì)菌門占所有序列的80%以上。

豐度排名前10的細(xì)菌門還包括擬桿菌門（Bacteroidetes，2.33%）、厚壁菌門（Firmicutes，2.19%）、Rokubacteria（1.90%）、奇古菌門（Thaumarchaeota，1.87%）以及藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria，0.51%）。

在上述細(xì)菌門中，施肥處理增加了表層土壤中綠彎菌門和奇古菌門的相對(duì)豐度，降低了變形菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度（圖1b）。

在下層土壤中，所有磷肥處理均降低了變形菌門、奇古菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度，但增加了放線菌門、綠曲菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度。

在屬水平上，所有土壤樣品中排名前10的細(xì)菌屬包括節(jié)桿菌屬（Arthrobacter，3.59%）、未鑒定的酸性細(xì)菌屬（unidentified_Acidobacteria，2.82%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，2.67%）、Gaiella（1.89%）、芽球菌屬（Blastococcus，1.87%）、Dongia（1.49%）、Skermanella（1.41%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，1.38%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，1.37%）、溶桿菌屬（Lysobacter，0.10%），這些細(xì)菌的豐度占所有序列的20%以下。在所有處理的上下兩個(gè)土層中，我們均觀察到這些細(xì)菌屬的相對(duì)豐度存在差異。

在表層土壤中，所有磷肥處理均增加了節(jié)桿菌、Gaiella和芽球菌屬的相對(duì)豐度。這三種細(xì)菌在60和120 kg P ha-1的條帶施肥處理中豐度高，而磷肥降低了芽孢桿菌和Dongia的豐度。

在下層土壤中，施加磷肥增加了節(jié)桿菌屬、芽球菌屬、Skermanella和芽孢桿菌屬的豐度，但降低了鞘氨醇單胞菌屬和溶桿菌屬的豐度。

除了在門和屬水平上存在的差異外，各種處理增加了不同細(xì)菌分類群的豐度。

以log10 LDA評(píng)分 > 4.0為標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)陂T、科、綱、目、屬或種水平上，在不同處理的上層土壤和下層土壤中分別鑒定出12個(gè)和4個(gè)生物標(biāo)志物，它們代表了所有處理中表層土和下層土之間的差異物種。

 TP0代表未施加磷肥；TT60和TT120分別代表60 kg P ha-1和120 kg P ha-1條帶施肥處理；ST60和ST120分別代表60 kg P ha-1和120 kg P ha-1均勻施肥處理。   

對(duì)于真菌而言，我們共鑒定到14個(gè)真菌門，188個(gè)真菌科以及307個(gè)真菌屬。在門水平上，子囊菌門（Ascomycota，55.67%）、被孢霉門（Mortierellomycota，10.18%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，8.46%）、毛霉菌門（Mucoromycota，0.62%）、壺菌門（Chytridiomycota，0.49%）、球囊菌門（Glomeromycota，0.26%）、芽枝霉門（Blastocladiomycota，0.13%）、油壺菌門（Olpidiomycota，0.02%）、Aphelidiomycota（0.02%）和梳霉門（Kickxellomycota，0.02%）是所有土壤樣品中豐度排名前10位的優(yōu)勢(shì)真菌門，這些真菌的豐度約占總真菌序列的75.87%。

在表層土壤的門水平上，與對(duì)照相比，所有磷肥處理均提高了子囊菌門、毛霉菌門、球囊菌門和油壺菌門的豐度。

但磷肥處理降低了擔(dān)子菌門和壺菌門的豐度。在下層土壤中，所有磷肥處理均增加了子囊菌門和油壺菌門的相對(duì)豐度，而降低了芽枝霉門的相對(duì)豐度。

在屬水平上，主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度排名前10的細(xì)菌屬）包括附球菌屬（Epicoccum，23.50%）、被孢霉菌屬（Mortierella，8.70%）、赤霉屬（Gibberella，4.54%）、鐮刀菌屬（Fusarium，4.54%）、Solicoccozyma（4.50%）、鏈格孢屬（Alternaria，3.31%）、Cladosporium（2.20%）、Pseudombrophila（1.94%）、Botrytis（1.44%）和絲核菌屬（Rhizoctonia，0.33%），這些真菌序列占所有序列的55.0%。

在表層土壤中，所有磷肥處理均提高了附球菌屬和Cladosporium的相對(duì)豐度，但僅降低了絲核菌屬的相對(duì)豐度。

在下層土壤中，磷肥施加提高了Cladosporium、鏈格孢屬和絲核菌屬的相對(duì)豐度，但降低了附球菌屬、Botrytis、Solicoccozyma以及絲核菌屬的相對(duì)豐度。

除門和屬水平上存在差異外，5個(gè)處理組均富集了部分真菌。

以 log 10 LDA評(píng)分 > 4.0為標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)陂T、科、綱、目、屬或種水平上，在不同處理的上層土壤和下層土壤中分別鑒定出8個(gè)和20個(gè)生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物代表了表層土和下層土之間的差異物種。 

微生物網(wǎng)絡(luò)分析

在不同施肥處理?xiàng)l件下，在表層土壤或下層土壤樣本中，基于磷貧瘠組和磷充足組之間的相關(guān)性（Spearman相關(guān)性，P< 0.05）對(duì)土壤微生物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行構(gòu)建。

對(duì)于條帶施肥處理而言，磷貧瘠組的表層土壤和磷充足組的表層土壤的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)分別由86個(gè)和87個(gè)節(jié)點(diǎn)以及200條和250條鏈接構(gòu)成。

對(duì)于均勻施肥而言，其土壤微生物網(wǎng)絡(luò)分別由85個(gè)節(jié)點(diǎn)（磷貧瘠）和80個(gè)節(jié)點(diǎn)（磷充足）以及384個(gè)鏈接（磷貧瘠）和255個(gè)鏈接（磷充足）構(gòu)成。

 在條帶施肥（a-b）或是均勻施肥（c-d）處理中，在磷充足（a，c）或磷貧瘠（b，d）條件下，基于16S rRNA基因測(cè)序所構(gòu)建的表層土壤（0-20 cm）微生物之間的連通性。

節(jié)點(diǎn)（彩色點(diǎn)）代表網(wǎng)絡(luò)中涉及的屬，鏈接代表節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系。紅線代表正相關(guān)關(guān)系（Spearman相關(guān)性，r > 0.7，P< 0.05），藍(lán)線表示負(fù)相關(guān)關(guān)系（Spearman相關(guān)性，r < - 0.7，P< 0.05）。

不同的彩色點(diǎn)代表屬所屬的不同門。節(jié)點(diǎn)內(nèi)的數(shù)字代表網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵屬。

對(duì)于條帶施肥處理下，在表層土壤樣本中，基于ITS基因所構(gòu)建的真菌網(wǎng)絡(luò)包括70