鄰域效應(yīng)影響植物葉際微生物群的種間變異

與植物葉片表面相關(guān)的微生物群落(即葉際微生物)在植物健康中的作用日益被人們重視。盡管越來越多的證據(jù)表明，宿主具有對(duì)其寄生微生物群的過濾作用，但人們對(duì)于葉際微生物群落組成是如何形成的（包括來自于鄰域植物擴(kuò)散的微生物群落）仍然所知甚少。本研究在為期三個(gè)月的田間試驗(yàn)中，對(duì)當(dāng)?shù)胤N植番茄、辣椒或大豆進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，宿主生長(zhǎng)在有同種鄰居或異種鄰居(或沒有鄰居)的環(huán)境中。每隔30天，收獲宿主植物并用新的年齡和物種匹配的植物進(jìn)行替換，同時(shí)讓附近的植物繼續(xù)生長(zhǎng)?；?/span>16S rRNA 基因序列的微生物群落分析表明，宿主過濾效應(yīng)的強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而減弱。與此相反，鄰域效應(yīng)的強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而增強(qiáng)，表明隨著鄰域植物生物量的增加，從鄰域植物的微生物擴(kuò)散對(duì)宿主葉際微生物變得更加重要。接下來，我們?cè)跍厥覂?nèi)進(jìn)行了交叉接種研究，利用田間植物產(chǎn)生的接種物在控制了微生物群落擴(kuò)散來源和方向的前提下直接測(cè)試了宿主對(duì)微生物群落的過濾能力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了鄰域效應(yīng)會(huì)影響葉際微生物群落的來源。結(jié)果表明，微生物傳播能力是葉層微生物群落組成的關(guān)鍵因素，鄰域植物種類、生物量、年齡等因素是葉層微生物群落多樣性的重要決定因素。    

結(jié)果

1. 不同鄰域植物的田間實(shí)驗(yàn)處理 本研究首先比較了沒有鄰域植物、同種鄰域植物和異種鄰域植物種植的宿主的葉際微生物群。田間試驗(yàn)持續(xù)了3個(gè)月，每個(gè)月都用相同物種的植物替換宿主。經(jīng)過處理后，216個(gè)田間宿主樣本中的175個(gè)獲得了高質(zhì)量的測(cè)序序列(番茄n=63，辣椒n=52，大豆n=60)。在這175個(gè)中，64個(gè)來自收獲時(shí)間點(diǎn)1，58個(gè)來自收獲時(shí)間點(diǎn)12，53個(gè)來自收獲時(shí)間點(diǎn)3。還有41個(gè)被排除的樣本的reads都小于24，因此既不能擴(kuò)增也不能產(chǎn)生序列。用于評(píng)估在移植到田間之前建立的宿主細(xì)菌群落的溫室對(duì)照植物產(chǎn)生的reads非常少(45個(gè)樣本中有28個(gè)的reads小于50)，這表明宿主移植前的細(xì)菌定植極少。宿主菌群以腸桿菌目、棒狀桿菌目、伯克氏菌目和假單胞菌目為主。 現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)集包含19,818個(gè) ASVs,的5,414,393次觀測(cè)值，其中13,455個(gè)出現(xiàn)>10次，2,253個(gè)出現(xiàn)>100次。在所有處理和宿主中，宿主內(nèi)ASVs水平的豐富度為22-769ASVs。豐富度水平隨采收時(shí)間的變化(F2,174=24.21,p<0.001)，在整個(gè)采收季節(jié)均呈下降趨勢(shì)，并隨宿主身份的變化而變化(F2,174=4.96,p<0.01)，其中大豆的豐富度較高，尤其是在第一次采收時(shí)。鄰域植物域?qū)?xì)菌豐度無影響，但收獲時(shí)鄰域植物的總花數(shù)與鄰域植物的細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(R2adj=0.044,p=0.01)。除宿主株重和株高與多樣性呈正相關(guān)(R2adj =0.022,p=0.03和R2adj=0.044,p<0.01)外，香農(nóng)多樣性的定性趨勢(shì)相似。

單株細(xì)菌受不同宿主(F2,174=27.35,p<0.001)、相鄰區(qū)域(F3,174=7.96,p<0.001)和收獲時(shí)間點(diǎn)(F2,174=3.85,p=0.051)的影響，各變量間的交互作用均。番茄和大豆植物比辣椒具有更高的細(xì)菌豐度(p<0.001)。單株豐度與株重(R2adj=0.187,p<0.01)和株高(R2adj=0.117,p<0.01)呈正相關(guān)。如果將細(xì)菌豐度歸一化，則發(fā)現(xiàn)宿主同一性(F2,174=3.24,p=0.041)和鄰域效應(yīng)(F3,174=2.17,p=0.094)較弱，而收獲時(shí)間點(diǎn)效應(yīng)較強(qiáng)(F2,174=5.15,p=0.024)。鄰域生物量(R2adj=0.146,p<0.001)、平均高度(R2adj =0.123,p<0.001)、花總數(shù)(R2adj=0.022,p=0.038)與宿主細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)。每個(gè)宿主植物群落豐富度(R2adj=0.016,p=0.05)與Shannon多樣性(R2adj=0.03,p<0.01)呈負(fù)相關(guān)?？偟膩碚f，葉際微生物群落以變形菌門、厚壁菌門和放線菌門為主。豐富的細(xì)菌目是芽孢桿菌目、伯克氏菌目、腸桿菌目、乳酸桿菌目、微球菌目、根瘤菌目、鞘單胞菌目和黃單胞菌目。聚類分析樣本之間的差異受收獲時(shí)間(R2=0.063,p=0.003),寄主物種(R2=0.055,p=0.003)、鄰居植物(R2 = 0.023, p = 0.048)，相鄰區(qū)域(R2=0.023,p=0.048)影響，宿主植物與收獲時(shí)間點(diǎn)之間具有的相互作用(R2=0.034,p=0.033)，鄰域植物與收獲時(shí)間點(diǎn)的作用呈相同趨勢(shì)(R2=0.041,p=0.072)。

2. 宿主特性對(duì)細(xì)菌群落組成的影響隨著時(shí)間的推移而減少，而鄰域效應(yīng)則隨著時(shí)間的推移而增加，并隨宿主特性的不同而變化

作者通過使用宿主物種（即番茄、辣椒或大豆）、鄰域（即番茄、辣椒、大豆或沒有鄰居植物）和實(shí)驗(yàn)區(qū)域（1-6）作為自變量對(duì)葉際微生物群落組成進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，宿主特性對(duì)葉際微生物群落的影響是的，但在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大小不同（時(shí)間點(diǎn)1：Adj.R2=0.096,p<0.001；時(shí)間點(diǎn)2：Adj.R2=0.068,p<0.001；時(shí)間點(diǎn)3：Adj.R2=0.027,p<0.001，）。相比之下，鄰域狀態(tài)的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)增加（時(shí)間點(diǎn)1：Adj.R2=0.001,p=0.242；時(shí)間點(diǎn)2：Adj.R2=0.017,p<0.01; 時(shí)間點(diǎn)3：Adj.R2=0.032,p<0.001，)。在收獲時(shí)未觀察到變量之間的相互作用。

變量包括:宿主物種(番茄、辣椒、或大豆), 鄰域(番茄、辣椒、大豆，無鄰域),和不同實(shí)驗(yàn)塊(1到6)。R 2 值代表模型的擬合， R 2 值已根據(jù)樣本數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以使值在不同收獲時(shí)間點(diǎn)之間具有可比性。 通過排除“無鄰域”變量對(duì)模型的影響，作者通過將鄰域（即番茄、大豆或辣椒）視為自變量來測(cè)試鄰域的影響。結(jié)果表明，在整個(gè)植物子集上，隨著時(shí)間的推移，宿主效應(yīng)減弱（時(shí)間點(diǎn)1：Adj.R 2= 0.114, p <0.001；時(shí)間點(diǎn)2：Adj.R 2 =0.050, p <0.001；時(shí)間點(diǎn)3：Adj.R 2 =0.024, p =0.007）和鄰域效應(yīng)增加（時(shí)間點(diǎn)1：Adj.R 2= 0.003, p =0.325；時(shí)間點(diǎn)2：Adj.R 2 =0.010, p =0.031；時(shí)間點(diǎn)3：Adj.R 2 =0.018, p =0.013)。并且僅在時(shí)間點(diǎn)3觀察到的實(shí)驗(yàn)塊效應(yīng)（Adj.R 2 =0.032, p =0.013），表明上述效應(yīng)趨勢(shì)受到“無鄰域”變量影響。 

為了進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)菌群落的豐度值是否會(huì)影響上述結(jié)論，作者將每個(gè)樣品中每個(gè)分類單元的相對(duì)豐度乘以每10μlDNA(用于測(cè)序文庫(kù)制備的體積量)的16SrRNA拷貝數(shù)，得出每個(gè)分類單元的豐度(準(zhǔn)豐度)的估計(jì)值。利用PERMANOVA程序?qū)Φ贸龅臄?shù)據(jù)進(jìn)行建模，得到了與相對(duì)豐度數(shù)據(jù)相同的定性結(jié)果。然而，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示宿主與鄰域植物的相互作用從收獲時(shí)間點(diǎn)2(R 2 adj =0.008, p =0.002)到收獲時(shí)間點(diǎn)3(R 2 adj =0.024, p =0.003)逐漸增加，表明鄰域效應(yīng)對(duì)宿主的影響取決于宿主的物種身份，而且這種影響隨著時(shí)間的推移變得更強(qiáng)。因此為了進(jìn)一步評(píng)估不同宿主植物對(duì)鄰域效應(yīng)的敏感性是否存在差異，作者將數(shù)據(jù)按植物種類進(jìn)行分類，并在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上分別評(píng)估鄰域效應(yīng)的強(qiáng)度。

結(jié)果表明，在時(shí)間點(diǎn)1，沒有植物表現(xiàn)出可檢測(cè)到的鄰域效應(yīng)。番茄作為宿主時(shí)在時(shí)間點(diǎn)3時(shí)僅表現(xiàn)出可檢測(cè)到的鄰域效應(yīng)(R 2 adj =0.086, p =0.009)，而在任何收獲時(shí)均沒有阻斷效應(yīng)。辣椒作為宿主時(shí)，在時(shí)間點(diǎn)2時(shí)僅存在鄰域效應(yīng)(R 2 adj =0.108, p =0.013)。大豆作為宿主時(shí)鄰域效應(yīng)僅在時(shí)間點(diǎn)3時(shí)才出現(xiàn)(R 2 adj =0.069, p =0.012)。 

3. 鄰域物種不同會(huì)減少宿主物種對(duì)葉際微生物群落的影響

為了驗(yàn)證有鄰域植物的宿主比沒有鄰域植物的宿主具有更高的宿主間擴(kuò)散率這一假設(shè)，作者對(duì)以鄰域植物狀態(tài)區(qū)分的宿主進(jìn)行了模型選擇。對(duì)鄰域矩陣分析的主坐標(biāo)生成的空間變量重復(fù)此過程，然后進(jìn)行變異劃分，劃分出宿主因子對(duì)葉際微生物群落多樣性的獨(dú)特貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，在時(shí)間點(diǎn)2和3中找到了支持上述推斷的證據(jù)證據(jù)，但沒有在時(shí)間點(diǎn)1中找到，表明了宿主間擴(kuò)散率依賴于鄰域植物的年齡結(jié)構(gòu)。對(duì)于時(shí)間點(diǎn)2和3，沒有鄰域植物對(duì)宿主的影響要強(qiáng)于有番茄、辣椒或大豆作為鄰域植物的植株。在收獲時(shí)，有鄰域植物的宿主比沒有鄰域植物的對(duì)照組具有更高的宿主物種識(shí)別效應(yīng)，這對(duì)于有番茄或大豆作為鄰域植物的宿主來說尤其如此。然而，在辣椒周圍的宿主中，宿主物種效應(yīng)遵循一個(gè)峰狀關(guān)系(先增加后減少)，而在番茄或大豆周圍的植物中觀察到的結(jié)果則是單調(diào)減少。這樣看來，隨著鄰域植物生物量的增加，宿主葉際微生物群落更多地受到來自鄰域植物的影響。

4. 宿主物種和時(shí)間不同影響系統(tǒng)發(fā)育聚類和中性模型擬合

為了更好地理解形成葉際微生物群落成員過程中的優(yōu)勢(shì)，并確定這三種植物是否可能受到不同裝配過程的影響，作者對(duì)系統(tǒng)發(fā)育聚類模式進(jìn)行了測(cè)試。宿主物種系統(tǒng)發(fā)育聚集的證據(jù)表明，系統(tǒng)發(fā)育的性狀是以宿主特有的方式被選擇的。并進(jìn)一步使用每個(gè)樣本中細(xì)菌ASV的平均成對(duì)距離(MPD)的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)量(SES)來檢驗(yàn)這一想法。結(jié)果表明，MPD SES受宿主物種(F2,175=219.86,p＜0.001)、收獲時(shí)間點(diǎn)(F2,175=12.33,p＜0.001)、寄主收獲互作(F4,175=43.84,p＜0.001)和鄰域植物(F3,175=3.38,p＜0.05)的影響。番茄和辣椒相關(guān)的群落在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育上的聚集性比預(yù)測(cè)的要高(如負(fù)的SES值所示)。相比之下，大豆相關(guān)群落則表現(xiàn)出系統(tǒng)發(fā)育過度分散的跡象。大豆的SES值隨著時(shí)間的推移呈下降趨勢(shì)，而且變化很大。一個(gè)例外是在收獲3時(shí)，沒有鄰域植物的大豆在MPD SES中具有高變異性，具有同種鄰域植物的大豆在系統(tǒng)發(fā)育上聚類，而具有番茄作為鄰域植物的豆類聚類過度分散（Tukey HSD檢測(cè)顯示同種鄰域植物和番茄鄰域植物p=0.02）。

SES=(MPDob–MPDnull)/SD(MPDnull)，其中低于0的值表明系統(tǒng)發(fā)育聚類。B)中性模型的擬合隨著時(shí)間的推移而下降，但因宿主身份而有很大差異。番茄（紅色實(shí)線）、辣椒（綠色點(diǎn)劃線）和大豆（藍(lán)色虛線）在每次收獲（x軸）中的中性模型擬合優(yōu)度值（R 2 ，y軸）。實(shí)心圓圈表示統(tǒng)計(jì)中具有性，而空心圓圈表示統(tǒng)計(jì)上不的影響（負(fù)值或0擬合值）。 作者進(jìn)一步擬合了一個(gè)中立模型，在這個(gè)模型中，被動(dòng)擴(kuò)散和生態(tài)漂移是建立葉際微生物群落的主要驅(qū)動(dòng)因素，并統(tǒng)計(jì)對(duì)這個(gè)模型的擬合是否隨著時(shí)間的推移而改變。結(jié)果表明，在三種宿主中，大豆相關(guān)群落的擬合優(yōu)度高，其次是番茄相關(guān)群落，表明宿主之間在形成群落結(jié)構(gòu)中的作用存在差異(圖5B)。在時(shí)間點(diǎn)1和2，大豆和番茄的中性模型擬合均呈下降趨勢(shì)(大豆:收獲1 R 2 =0.483，收獲2 R 2 =0.074;番茄:收獲1 R 2 =0.214, 收獲1 R 2 =0.052)，時(shí)間點(diǎn)3上，中性模型沒有對(duì)兩組植株進(jìn)行擬合(顯示為負(fù)擬合優(yōu)度值)。在這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，辣椒宿主均未被中性模型擬合(顯示為負(fù)擬合優(yōu)度值)。 

5. 溫室實(shí)驗(yàn)揭示接種源不同對(duì)葉際微生物群落的影響 

為進(jìn)一步研究葉際微生物群落在宿主間傳播所受到的影響，作者隨后進(jìn)行了溫室中的研究。從田間回收的葉際微生物群落被移植到收集它們的相同植物物種上，或移植到原植物周圍的植物物種上。在總共105個(gè)這樣的相互接種中，103個(gè)樣本產(chǎn)生了足夠的高質(zhì)量序列進(jìn)行分析。結(jié)果數(shù)據(jù)集包含1734個(gè)序列的2,640,588個(gè)觀測(cè)值，其中1379個(gè)出現(xiàn)超過10次，其中621個(gè)出現(xiàn)超過100次。 結(jié)果表明，樣品的序列豐度與溫室樣品中可檢測(cè)到的接種物序列數(shù)量呈線性關(guān)系(R 2 adj =0.105, p =0.004)。接種物和實(shí)驗(yàn)植物之間重疊序列的數(shù)量與宿主物種同一性  (F 2,88 =8.503, p ＜0.001)，接種物取樣的前一個(gè)寄主物種(F 2,88 =3.871, p ＜0.001)，寄主與前一個(gè)寄主之間(F 4,88 =2.598, p =0.03)，寄主和前一個(gè)鄰域物種之間的相互作用相關(guān)(F 4,88 =2.968, p =0.03)。與野外研究相似，葉際微生物群落以變形菌門和厚壁菌門為主。豐富的細(xì)菌目為芽孢桿菌目、伯克氏菌目、腸桿菌目和假單胞菌目。處理植物上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與僅應(yīng)用無菌緩沖液的對(duì)照植物不同(PERMANOVA R 2 =0.056, p =0.048)。進(jìn)一步使用熱滅活的接種物作為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。

結(jié)果表明，接受熱滅活接種的植物與接受活接種物的植物相比，其與宿主物種的差異性更小。根據(jù)實(shí)驗(yàn)植物是否接受來自異種（不同物種）或同種（相同物種）宿主的接種物對(duì)樣本進(jìn)行子集化，結(jié)果表明異種移植比同種移植產(chǎn)生更多可區(qū)分的宿主（Adj.R 2 =0.123, p <0.001 vs Adj.R 2 =0.109, , p <0.001）。因此，接受活接種物的處理植物更有效地推動(dòng)了葉際微生物的分化，并且異種特異性接種源進(jìn)一步促進(jìn)了葉際微生物分化。 作者通過指示物種分析確認(rèn)了在田間試驗(yàn)(時(shí)間點(diǎn)2)和溫室試驗(yàn)中在三種宿主物種上富集的微生物群落。在田間可用來區(qū)分辣椒宿主的34個(gè)微生物群落中，有6個(gè)是在溫室數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的，這些微生物群落的集體相對(duì)豐度在溫室中的辣椒植物上顯著高于番茄（ Tukey HSD p ＜0.001））或豆類（ Tukey HSD p ＜0.001）。溫室中發(fā)現(xiàn)了25個(gè)區(qū)分番茄的分類群，并且番茄（ Tukey HSD p ＜0.05）和辣椒（ Tukey HSD p ＜0.01）植物上這些類群的總體相對(duì)豐度高于豆類。溫室中發(fā)現(xiàn)了27個(gè)區(qū)分豆類的分類群，但它們的相對(duì)豐度在宿主之間沒有差異（ p >0.05）。 

6. 溫室實(shí)驗(yàn)揭示接種源不同對(duì)葉際微生物群落的影響

宿主中序列水平的豐度范圍為24~231個(gè)序列，且受宿主物種身份(F2,74=12.41, p＜0.001)、宿主與原宿主身份之間的交互作用(F4,74=3.50, p＜0.05)和實(shí)驗(yàn)群落影響(F4,74=2.43, p=0.058)。3種植物中，辣椒的豐富度高于番茄和大豆(p<0.001)，但兩者之間差異不(p>0.05)。當(dāng)接種為同源轉(zhuǎn)移(即在同一種植物的兩個(gè)植株之間移動(dòng))時(shí)，供體植株生物量和受體植株豐富度之間呈負(fù)相關(guān)但弱相關(guān)(Adj.R2=0.09,p<0.05)。然而，當(dāng)接種為異種轉(zhuǎn)移(即在兩種不同的植物物種之間)時(shí)，供體植物生物量和受體植物豐富度之間存在強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系(Adj.R2=0.21,p<0.01)。在同種移植物與異種移植物間豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。

7. 葉際微生物群落移植實(shí)驗(yàn)揭示了不同宿主物種以及供體植物鄰域植物的影響

基于Bray Curtis差異的研究表明，不同宿主物種(R2=0.127, p<0.001)、先前的宿主物種(即接種物的來源) (R2=0.468, p<0.001)和實(shí)驗(yàn)塊(R2=0.156, p<0.001)均對(duì)實(shí)驗(yàn)溫室植物的葉際群落結(jié)構(gòu)差異有影響。此外，我們還觀察了供體植物生物量對(duì)受體植物葉際群落結(jié)構(gòu)的影響((R2=0.018,p=0.05)。溫室辣椒的葉層群落結(jié)構(gòu)存在“祖父母效應(yīng)”。也就是說，辣椒葉際群落強(qiáng)烈地受到前宿主的鄰居的影響(R2=0.194,p<0.001)。辣椒葉際群落結(jié)構(gòu)與先前宿主的物種身份也存在一定的相關(guān)性(R2=0.107,p=0.061)。與在辣椒上觀察到的結(jié)果相反，在番茄或大豆亞群上既沒有觀察到先前的鄰居效應(yīng)，也沒有觀察到先前的宿主效應(yīng)。