1992年，吩噻嗪染色體和可見(jiàn)光聯(lián)合作用來(lái)滅活袋裝血漿的個(gè)病毒滅活方法已經(jīng)被描述，該方法稱(chēng)作Springe法。自1993年，這種方法已經(jīng)被應(yīng)用于德國(guó)和瑞士的許多紅十字輸血服務(wù)機(jī)構(gòu)。有100多萬(wàn)單位的新鮮冰凍血漿已經(jīng)被用于臨床，收到了良好的臨床效果而且沒(méi)有任何明顯的副作用。
百特公司已經(jīng)簡(jiǎn)化并改善了亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活法。
表1 Spring 程序與百特程序的對(duì)比
程序數(shù)據(jù) | Springe 程序 | 百特程序 |
用于細(xì)胞內(nèi)病毒的滅活或去除的方法 | 用凍融法去除白細(xì)胞 | 用0.8微米的過(guò)濾器去除白細(xì)胞，后進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)處理 |
新鮮冰凍血漿制備需要的凍融法的次數(shù) | 1 | 0 |
每單位新鮮冰凍血漿所添加的亞甲藍(lán) | 85-120微克 | 74-92微克 |
光源 | 白色熒光燈管 | 白色熒光燈管 |
光照度 | 1小時(shí)周期60000lux（37J/cm2）,手動(dòng)控制 | 30分鐘周期33 J/cm2，未處理程序控制 |
光照條件 | 血袋單面進(jìn)行光照，不需擺動(dòng) | 血袋雙面進(jìn)行光照，不需擺動(dòng) |
光照的容器 | 采血時(shí)用的血袋 | 一次性使用的 |
百特系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是光化學(xué)程序的標(biāo)準(zhǔn)化，它用一個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的袋子，在一個(gè)密閉的系統(tǒng)內(nèi)，向每單位血漿中添加等量的亞甲藍(lán)，并且通過(guò)未處理程序控制光照來(lái)提供等量的照度。見(jiàn)圖1。
這種標(biāo)準(zhǔn)化能提高血漿蛋白的回收，而且這種方法可以被應(yīng)用于任何血液中心。
此項(xiàng)研究的目的是評(píng)估用百特法滅活的血漿在健康志愿者體內(nèi)的臨床和生化相容性。當(dāng)?shù)氐膫惱頇C(jī)構(gòu)同意了該研究。
材料和方法
設(shè)計(jì)：
該試驗(yàn)是隨意組合的。2單位的自體同源新鮮冰凍血漿（或者經(jīng)過(guò)處理或者沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理）經(jīng)過(guò)隨機(jī)選擇被輸入到健康的志愿者體內(nèi)。兩周以后，將接受了處理過(guò)的血漿的志愿者與接受等量的未經(jīng)處理的血漿的志愿者進(jìn)行比較。
亞甲藍(lán)處理
裝置是一次性使用亞甲藍(lán)設(shè)備，試驗(yàn)編號(hào)是GURX0052。每套設(shè)備包括PL732轉(zhuǎn)移袋，袋內(nèi)有10毫升的亞甲藍(lán)，轉(zhuǎn)移袋與一個(gè)去白細(xì)胞濾器相連接。血漿在無(wú)菌狀態(tài)下連接到裝置上，并在重力的作用下通過(guò)過(guò)濾進(jìn)入轉(zhuǎn)移袋，轉(zhuǎn)移袋內(nèi)亞甲藍(lán)的量是74-92μg/單位血漿。緩慢混合后，血漿袋被放入白光照射設(shè)備中，在33J/cm2的光照下照射30分鐘。
血漿的冰凍和溶解
血漿分離后，溶解的血漿即刻開(kāi)始輸注。每?jī)蓡挝谎獫{的輸注時(shí)間是45分鐘。兩單位血漿輸注后，血漿中亞甲藍(lán)的峰值是40-60ng/毫升。
| 組1 | 組2 |
0周 | 分離血漿600毫升 分成兩袋，每袋275毫升 用亞甲藍(lán)處理血漿 將兩袋亞甲藍(lán)處理的血漿冰凍貯存 | 分離血漿600毫升 分成兩袋，每袋275毫升 不用亞甲藍(lán)處理血漿 將兩袋未經(jīng)亞甲藍(lán)處理的血漿冰凍貯存 |
2周 | 分離血漿600毫升 分成兩袋，每袋275毫升 不用亞甲藍(lán)處理血漿 將兩袋未經(jīng)亞甲藍(lán)處理的血漿冰凍貯存 溶解并輸注在0周內(nèi)貯存的兩單位的亞甲藍(lán)處理的自體同源血漿 | 分離血漿600毫升 分成兩袋，每袋275毫升 用亞甲藍(lán)處理血漿 將兩袋亞甲藍(lán)處理的血漿冰凍貯存 溶解并輸注在0周內(nèi)貯存的兩單位的未經(jīng)亞甲藍(lán)處理的自體同源血漿 |
4周 | 分離血漿600毫升 溶解并輸注在2周內(nèi)貯存的兩單位的未經(jīng)亞甲藍(lán)處理的自體同源血漿 | 分離血漿600毫升 溶解并輸注在2周內(nèi)貯存的兩單位的亞甲藍(lán)處理的自體同源血漿 |
試驗(yàn)結(jié)果：
A 受控組與測(cè)試組之間有數(shù)據(jù)上的不同。但是所有的數(shù)據(jù)在正常范圍內(nèi)并且檢測(cè)不到會(huì)出現(xiàn)的新鮮冰凍血漿的不同效用。
B 關(guān)于纖維蛋白原的功能分析等。在任何時(shí)間點(diǎn)上都沒(méi)有顯著的區(qū)別。
C 在受控組和經(jīng)亞甲藍(lán)處理的血漿之間沒(méi)有明顯區(qū)別。
D 關(guān)于凝血酶時(shí)間。凝血酶時(shí)間提高了大約1秒。但是測(cè)試組和受控組沒(méi)有明顯區(qū)別。
樣品的收集
圖示中T00代表：樣品收集后，血漿分離前
T0代表：血漿分離后，血漿輸注前
T30M代表：血漿輸注后30分鐘
T1H：血漿輸注后1小時(shí)
T4H：血漿輸注后4小時(shí)
T24H：血漿輸注后24小時(shí)
T4D：血漿輸注后4天
分離程序在0周、2周、4周內(nèi)做3次（見(jiàn)表2）。所有的樣品在2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)或者用液態(tài)氮瞬間冷凍，并且在做實(shí)驗(yàn)前貯存在零下80度環(huán)境中。
試驗(yàn)分析
血漿獻(xiàn)血者的篩選工作在0周和2周的T00時(shí)間，篩選包括傳染性疾?。ò滩?、B型肝炎、C型肝炎、人T細(xì)胞白血病病毒）和分組的血液以及預(yù)料不到的抗體（僅在第0周）。完全安全的篩選工作在第0周的T00時(shí)間，第2周和第四周的T00、T30M和T24H，并且包括血色素和血球容積的篩選。血球容積用coulter microdiff 18 進(jìn)行分析，血漿血色素用一種分光光照度（philips pu 8720 uv/vis）進(jìn)行測(cè)試。血細(xì)胞用coulter microdiff18 進(jìn)行計(jì)數(shù)，其中血小板用coulter skts j進(jìn)行計(jì)數(shù)。血液的化學(xué)性（鈉、鉀、尿素、肌氨酸酐和總蛋白）用hitachi917進(jìn)行分析。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶用hitachi 917進(jìn)行分析。完全的生化篩選工作在第0周的T00時(shí)間和第2周、第4周的T00、T30M、T24時(shí)間，該項(xiàng)工作包括：活化部分凝血活酶時(shí)間，凝血酶原時(shí)間，凝血酶時(shí)間，Ⅷ因子，Ⅵ因子，纖維蛋白原，用一種凝血分析儀（ACL300血凝度測(cè)量器）進(jìn)行的功能分析。另外，纖維蛋白原用HATACHI910通過(guò)免疫分析進(jìn)行測(cè)定。纖維蛋白的降解產(chǎn)品用LATEX產(chǎn)品手動(dòng)法進(jìn)行分析。
限制的生化篩選工作在第2周和第4周的T0,T1H,T4H,T4D時(shí)間，并包括活化部分凝血活酶時(shí)間，凝血酶原時(shí)間，凝血酶時(shí)間和纖維蛋白原。限制的安全篩選工作在第2周和第4周的DI T4H和T4D時(shí)間，并包括血色素，血球容量計(jì)，血細(xì)胞的計(jì)數(shù)。補(bǔ)體激活測(cè)試在第2周、第4周的T0和T30M時(shí)間，并包括C3a,C5a和C1酶抑制劑，所用方法是ELLSA法。百特公司的生化實(shí)驗(yàn)室做了補(bǔ)體分析。
高鐵血紅蛋白和亞甲藍(lán)劑量試驗(yàn)在第2周和第4周的T0,T30MHE T1H時(shí)間進(jìn)行。
檢測(cè)限值：亞甲藍(lán)：4.1ng/ml
天青A：3.8ng/ml
天青B：5ng/ml
天青C：7.1ng/ml
亞氨嗉：10.7ng/ml
血小板凝聚測(cè)試者是6名志愿者，時(shí)間是第0周的T00和第2周、第4周的T30M時(shí)間。
結(jié)果：
受試者：
所有的受試者均在試驗(yàn)之前做出了口頭同意，他們接受了獻(xiàn)血漿指導(dǎo)，并且對(duì)初的醫(yī)療檢測(cè)表示滿(mǎn)意，他們都沒(méi)有檢測(cè)出任何有傳染性病毒。并對(duì)那些意料之外的血液抗體進(jìn)行了篩查。
次血漿分離前，受試者被隨機(jī)分配到1組和2組，所有的受試者為男性，他們的年齡在20-30之間，體重在61.5-75千克之間。
第0周，所有的個(gè)體均被測(cè)試。1組和2組在血小板計(jì)數(shù)，血小板容積，白細(xì)胞計(jì)數(shù)，血細(xì)胞比容，血紅蛋白，鈉，鉀，尿素，總蛋白，激活部分凝血活酶時(shí)間，凝血酶時(shí)間，纖維蛋白原，纖維蛋白分解產(chǎn)物Ⅷ因子Ⅺ因子方面沒(méi)有區(qū)別。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)上，2組和1組之間在激活部分凝血活酶時(shí)間上有差別，但是，都在正常范圍之內(nèi)。
血漿的分離與亞甲藍(lán)處理
血漿的分離程序以及事故被記錄。預(yù)定的600毫升血漿可以從所有的受試者得以收集，只要在第0周，第1受試者只能提供509毫升血漿。所有的亞甲藍(lán)處理的血漿均在具體的重量范圍之內(nèi)。所有的血漿均成功的經(jīng)過(guò)亞甲藍(lán)處理。在凍融過(guò)程中，兩單位血漿被損壞。
醫(yī)療觀察和副反應(yīng)
血漿分離程序期間或以后，沒(méi)有出現(xiàn)抱怨或副反應(yīng)。不論是在輸血過(guò)程還在輸血后24小時(shí)已經(jīng)4天后，受損血漿或亞甲藍(lán)處理的血漿均與受試者的抱怨無(wú)關(guān)。
測(cè)量的數(shù)據(jù)
數(shù)據(jù)的分析
進(jìn)行了順序顛倒后的效果測(cè)試并做了數(shù)據(jù)記錄。方法如下：1組（第2周-第4周）與2組（第4周-第2周）做比較，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的效果。受控輸血的數(shù)據(jù)與亞甲藍(lán)輸血的數(shù)據(jù)（受試者數(shù)目=12，第2周，第4周）作比較。
臨床數(shù)據(jù)：在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)血壓和脈率做了測(cè)量。血漿分離后，血壓和脈率有明顯降低，隨后有恢復(fù)到了初始值。受試者與受控組之間沒(méi)有明顯區(qū)別。
安全數(shù)據(jù)
血細(xì)胞數(shù)量（血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞）、血細(xì)胞比容、血紅素在每一時(shí)間點(diǎn)上做了測(cè)量。血漿分離前、輸血后30分鐘和24小時(shí)后，納、鉀、尿素、總蛋白、血漿血紅蛋白被進(jìn)行了測(cè)量。
測(cè)試組和受控組在以上任何數(shù)據(jù)上都沒(méi)顯示儲(chǔ)明顯不同。血漿分離后，能觀察到白細(xì)胞數(shù)目和血小板數(shù)目的降低。分離血漿的輸注可能導(dǎo)致血濃縮，這會(huì)影響紅細(xì)胞數(shù)，血細(xì)胞比容，血紅蛋白和總蛋白。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒性特征?？赡苡捎跇悠吩?，血漿血紅蛋白會(huì)有偶爾下降。但是兩組之間沒(méi)有區(qū)別。沒(méi)有產(chǎn)生高鐵血紅蛋白。
凝血數(shù)據(jù)
激活部分凝血活酶時(shí)間、部分凝血活酶時(shí)間、纖維蛋白原在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均被進(jìn)行了測(cè)試。在血漿分離前、輸血后30分鐘和24小時(shí)均對(duì)纖維蛋白原、纖維蛋白講解產(chǎn)物、Ⅷ因子Ⅺ因子進(jìn)行了測(cè)試。
受控組和測(cè)試組在激活部分凝血活酶時(shí)間上有數(shù)據(jù)上的不同。血漿輸注后，激活部分凝血活酶時(shí)間縮短了1秒?？傊?，所有數(shù)據(jù)均在正常范圍內(nèi)，并且檢測(cè)不到新鮮冰凍血漿輸注效果有任何不同。兩組之間，部分凝血活酶時(shí)間、纖維蛋白原、Ⅷ因子Ⅺ因子在任何時(shí)間點(diǎn)上都沒(méi)有顯著的區(qū)別。纖維蛋白降解產(chǎn)物一直低于臨床可接受的數(shù)值。程序以后，所以受試者的凝血酶時(shí)間增長(zhǎng)了大約1秒，但是測(cè)試組和受控組之間沒(méi)有明顯區(qū)別。
血小板聚集：不論是亞甲藍(lán)處理血漿的輸注還是受控血漿的數(shù)值均未檢測(cè)到到血小板聚集的影響。
補(bǔ)體激活：不論是受控組還是測(cè)試組均檢測(cè)不到補(bǔ)體激活。
亞甲藍(lán)及其衍生物：用于檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)及其衍生物的樣品在T0,T30M,T1H時(shí)間從接受了亞甲藍(lán)處理的血漿的志愿者體內(nèi)的以恢復(fù)。所有的檢測(cè)結(jié)果均低于檢測(cè)限值。
討論：
用亞甲藍(lán)與可見(jiàn)光結(jié)合的方法的生化背景以及這種方法的病毒滅活的效果已為眾人所知并且已在其它地方進(jìn)行了討論。百特公司將一過(guò)濾步驟添加到光化學(xué)病毒滅活呈現(xiàn)在用于濾除細(xì)胞內(nèi)有傳染性的物質(zhì)，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)有傳染性的物質(zhì)對(duì)已知的滅活方法有抵抗作用，而該方法能夠?yàn)V除這些物質(zhì)，所以，百特公司改善了病毒滅活方法。更重要的是，該方法去掉了冰凍步驟加上光化學(xué)程序的標(biāo)準(zhǔn)化，所以，該法能夠提高凝血因子的回收。
該研究旨在評(píng)價(jià)用百特公司程序經(jīng)亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法處理的血漿在健康的志愿者體內(nèi)的臨床和生化相容性。輸注的血漿為每千克體重7.3-8.8毫升。因?yàn)檠虮热莸木禐?3%，健康的成人的血量為每千克體重71毫升，所以可以有大約20%的血漿被新鮮冰凍血漿所取代。盡管這個(gè)量低于每千克體重12-15毫升（這是英國(guó)目前所建議的治療的范圍值）但是，這個(gè)量卻可以使我們能夠觀察到亞甲藍(lán)處理血漿的即時(shí)或延后的毒性效果，因?yàn)榇隧?xiàng)研究的設(shè)計(jì)足夠敏感可以檢測(cè)到由于分離血漿的輸注而引起的測(cè)量數(shù)據(jù)的改變。我們檢測(cè)到亞甲藍(lán)處理血漿對(duì)凝血數(shù)據(jù)沒(méi)有消極影響。沒(méi)有觀察到補(bǔ)體激活。用一種標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)血小板聚集，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有激活現(xiàn)象。臨床數(shù)據(jù)也沒(méi)有被影響。該項(xiàng)研究的設(shè)計(jì)對(duì)由于亞甲藍(lán)程序引起的改變非常敏感，所以我們認(rèn)為的由亞甲藍(lán)所引起的能夠影響凝血蛋白的任何改變都會(huì)被識(shí)別出。我們認(rèn)為沒(méi)有改變是個(gè)非常重要的信息，因?yàn)榧词故呛苄〉母淖兌紩?huì)對(duì)病人的恢復(fù)產(chǎn)生消極的影響，而且亞甲藍(lán)處理血漿的有效性也好大大降低。更重要的是，亞甲藍(lán)處理法不會(huì)對(duì)血漿系統(tǒng)產(chǎn)生臨床上的明顯的消極影響。
在目前的研究中，即使用敏感的方法來(lái)檢測(cè)殘留的亞甲藍(lán)和衍生物，血漿中仍然不存在殘留亞甲藍(lán)或它的衍生物，或者至少是，血漿輸注30分鐘和1小時(shí)后，殘留亞甲藍(lán)和它的衍生物低于檢測(cè)限值。從前期臨床數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)來(lái)看，亞甲藍(lán)能夠迅速地從循環(huán)系統(tǒng)中消失，亞甲藍(lán)的降低是由于糞便的排出。由于亞甲藍(lán)在血液中不會(huì)堆積，所以在血漿交換過(guò)程中能達(dá)到的大濃度將會(huì)與新鮮冰凍血漿中的亞甲藍(lán)濃度相等，大約是每毫升150納克，而臨床可接受的亞甲藍(lán)的量大是每毫升15毫克，是亞甲藍(lán)血漿輸注的10000倍 。在目前的研究中，可以用亞甲藍(lán)在血液中的降低來(lái)彌補(bǔ)亞甲藍(lán)及其衍生物檢測(cè)手段的缺失。該研究確信：亞甲藍(lán)處理的血漿可以被安全地輸注，因?yàn)樗鼘?duì)凝血蛋白沒(méi)有負(fù)面影響，臨床上也沒(méi)有任何顯著的負(fù)面影響。
因此，我們認(rèn)為，以上所描述的在一個(gè)密閉的系統(tǒng)內(nèi)對(duì)單位血漿進(jìn)行處理的亞甲藍(lán)-光照病毒滅活法是一個(gè)有價(jià)值的轉(zhuǎn)變，它的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在該系統(tǒng)包含一個(gè)能夠?yàn)V除任何細(xì)胞內(nèi)有傳染性的物質(zhì)的過(guò)濾步驟。
上述資料可以說(shuō)明亞甲藍(lán)處理的血漿可以被安全地輸注，因?yàn)樗鼘?duì)凝血蛋白沒(méi)有負(fù)面影響，臨床上也沒(méi)有任何顯著的負(fù)面影響。
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