硫化氫誘發(fā)疼痛大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基的表達(dá)變化

         硫化氫(HZ幻是繼一氧化氮和一氧化氮(CO)之后體內(nèi)第3種氣體分子它可作用于不同的離子通道和受體,參與調(diào)節(jié)多種生理功能,并在痛覺(jué)信息傳遞中發(fā)揮著重要作用.一3一N一甲基_D一天冬氨酸(NMDA)2B亞基(NR2B)作為NMD受體的重要功能業(yè)基,參與傷害性信息傳遞和中樞敏化的形成一4,而H,S誘發(fā)的疼痛與脊髓背角NR2B表達(dá)變化的關(guān)系目前尚不清楚.我們采用足底注射Naffs以誘發(fā)大鼠持續(xù)性疼痛,通過(guò)給予NMDA受體拮抗劑氯胺酮,觀察氯胺酮對(duì)H,S誘發(fā)疼痛大鼠脊髓背角VR2B亞基表達(dá)變化的影響,探討H,S誘發(fā)大鼠疼痛形成的機(jī)制.
         材料和方法 
         1.動(dòng)物選擇及分組:清潔級(jí)雄性SD大鼠,7周齡,體質(zhì)量180一200g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供大鼠飼養(yǎng)環(huán)境安靜,室溫20}250},自由進(jìn)食水-待大鼠適應(yīng)環(huán)境后,采用隨機(jī)數(shù)字表法.將大鼠隨柯[分為3組:對(duì)照組(C組),H=}I}(組)和氮嘆酮組(K組升.
         2.模型制備及給藥:S組和K組每天經(jīng)后足底給子H,S的供體NaHS(美國(guó)Sigma-Alrich公司)1ntnol(生理鹽水稀釋至0.1ml),C組給予等體積生理鹽水,1次/天,連續(xù)Sd,后1次足底給藥后,測(cè)定機(jī)械縮足閡值,當(dāng)17值低于49,為成功的疼痛模型然后開始肌肉注別給藥,K組每天肌肉注射鹽酸氯胺酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào)H32022820)10mg/kg(生理鹽水稀釋至0.2m1),5組和C組則同時(shí)給子等體積生理鹽水,1次/天,連續(xù)7d.
         3.機(jī)械縮足I值(PWT)的測(cè)定:參照文獻(xiàn)5,以足底給予NaHS或生理鹽水時(shí)間點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn),分別于足底給藥前1d(T)、第1次足底給藥后20min(T1)、第5次足底給藥后20min(12)及肌肉注射后第7天(T3)測(cè)定PWT將大鼠置于底部帶有金屬網(wǎng)的有機(jī)玻璃箱中,待大鼠適應(yīng)環(huán)境后,用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的\VonFrey纖維絲(美國(guó)StoeltingWood公司)垂直刺激大鼠足底中心部位,使其彎曲成S形,持續(xù)8s,大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開vonFrey}纖維絲即刻發(fā)生快速的縮足反應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng),直至出現(xiàn)第1次陽(yáng)性陰性(或陰性陽(yáng)性)反應(yīng)的騎跨,連續(xù)4次.采用Dixon-一介紹的方法計(jì)算50%縮足反應(yīng)闌值為PWT.
         4取材:3組大鼠均在后1次PBX--T測(cè)定完成后腹腔注射苯巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)H31020532)60m郭kg麻醉,取脊髓腰膨大部并迅速置于液氮中逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定脊髓背角NR2BmRNA表達(dá),Westernblot法測(cè)定脊髓NR2B蛋自表達(dá),每種方法3組各采用5只大鼠進(jìn)行測(cè)定.
         5.脊髓背角NR2BmRNA表達(dá)的測(cè)定:取脊髓膨大部組織50mg,采用Trizol總RNA提取試劑盒(北京艾德萊公司)提取總RNA采用紫外吸收法測(cè)定RNA濃度及純度參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),20閃反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:420C60min,720C5min,PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25p1o內(nèi)參基因的(G}PDH)的反應(yīng)條件為950C5min,36個(gè)PCR循環(huán)(940C30s;580C45s;72℃30s),72℃延伸5min_NR2B基ICI的反應(yīng)條件為95℃5min,40個(gè)PCR循環(huán)(95〔30s;61℃1min;72〔30、),72℃延伸5min引物序列如下:GAPDH(252by)上游引物5'-A(:AGCAACAGGGTGGTGGA-3',下游引物50(W:AGCGAACTT-3'NR2B(475by);上游引物5'-}c-;GAAGCCACCTACATTTTTGA-3',下游引物5'-CGAGGCCACAC.}TAATACTTCA-3'0PCR引物均由北京賽百盛公司合成取PCR產(chǎn)物,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定采用Quant沂One4.2軟件進(jìn)行分析,以目的基因灰度值與GAPDH灰度值的比值反映NR2B受體mRN.A的表達(dá)水平.
         6.Vesternblot法測(cè)定脊髓背角NR2B蛋白的表達(dá)水平:取脊髓背角在細(xì)胞裂解液中勻漿,分離提取L:"蛋白二喳琳甲酸(BC)法(試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司)測(cè)定樣本總蛋白濃度.以50},g蛋白在gcJ}十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(sDS-PAGE.)膠上電泳分離后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上.用5%脫脂牛奶封閉1h,在4℃條件下用NR2B抗體(英國(guó)Abcom公司,I:1000稀釋)和件肌動(dòng)蛋白((3-actin,美國(guó)SantaCruz公司,1:500稀釋)孵育過(guò)夜,經(jīng)TBST洗膜后于室溫下加人辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液(美國(guó)SantaCru,公司,1=5000稀釋)中孵育2h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯像.
采用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析儀(美國(guó)UVP公司)采集圖像,QuantityOne4.2軟件進(jìn)行分析,以目的蛋白灰度值與階actin灰度值的比值反映NR2B蛋白的表達(dá).
         7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x1s)表示,組間比較采用單因素方差分析.
        

          結(jié)果
         與C組比較,S,K兩組在T1及T2PST均明顯降低(P<0.05);與S組比較,K組在T3PBX-T升高(P<0.05,表1).與C組比較,S組在給予NaHS7d后NR2BniRN表達(dá)明顯增多(P<0.05);與S組比較,K組在給予7d氯胺酮后NR2BmRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05)3組大鼠脊髓背角NR2B受體mRNA表達(dá)變化見(jiàn)圖1,表2.
         與C組比較,S組給予NaHS7d后NR2B蛋自表達(dá)明顯升高(P<0.05);與S組比較,K組在給予氯胺酮7d后NR2B蛋自表達(dá)顯著降低(P<0.05)〕3組大鼠脊髓背角NR2B受體蛋自表達(dá)變化見(jiàn)圖2,表2.
         討論
         在體內(nèi)H,S在心血管,胃腸道,神經(jīng)保護(hù)與毒性及疼痛調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著作用,其作用靶點(diǎn)包括鈣離子通道、鉀離子通道、NMDA受體等.本研究結(jié)果顯示,單次經(jīng)足底給予NaHS20min后,大鼠PW7,明顯下降,而連續(xù)給予NaHS5d后大鼠PW7{明顯降低,且可持續(xù)至少1一2周.本研究結(jié)果表明,足底連續(xù)注射HZS后可致大鼠產(chǎn)生持續(xù)性痛覺(jué)過(guò)敏.
         氯胺酮是臨床上應(yīng)用較廣泛的一類麻醉鎮(zhèn)痛藥.它是非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體的拮抗劑,主要作用于NMDA受體的苯環(huán)AjAi}}PCP)位點(diǎn),從而拮抗NMDA受體的激活目前氯胺酮已廣泛應(yīng)用于臨床鎮(zhèn)痛,臨床上小劑量氯胺酮的定義為一次肌肉注射量<2m剔kg,經(jīng)靜脈或硬膜外<1m郭kg,或經(jīng)靜脈持續(xù)輸注速率蕊20N.,g/(kg"min)9我們采用臨床上常用的肌肉注射方式,動(dòng)物肌肉注射氯胺酮lOm到kg,其劑量經(jīng)換算相當(dāng)于臨床患者肌肉注射1.5mg/kg,該劑量屬于臨床上小劑量氯胺酮的范疇.本研究結(jié)果顯示,在HZS誘發(fā)的大鼠持續(xù)性疼痛中,氯胺酮重復(fù)肌肉注射可以使大鼠PITT升高,說(shuō)明氯胺酮在一定程度上可以緩解HZS誘發(fā)的痛覺(jué)過(guò)敏.給予氯胺酮1周后大鼠脊髓背角NR2B的mRNA及蛋自表達(dá)水平均較S組下降,它說(shuō)明氯胺酮可能通過(guò)抑制NR2B的表達(dá)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果.
         本研究結(jié)果表明,H,S誘發(fā)的持續(xù)性痛覺(jué)過(guò)敏可能與NR2B的上調(diào)相關(guān),而氯胺酮可以抑制其表達(dá),從而在一定程度上緩解H>S誘發(fā)的持續(xù)性痛覺(jué)過(guò)敏.
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