懸浮培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞球具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征

　　腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤中一小群具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞維持著腫瘤的自我更新和分化，參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，這部分細(xì)胞被稱為“腫瘤干細(xì)胞("CSC)”或“腫瘤起始細(xì)胞(TIC)。可以預(yù)見(jiàn)，CSC將是非常關(guān)鍵的腫瘤治療的靶細(xì)胞。但CSC所占比例極低，極難獲得足夠的CSC進(jìn)行深人研究。因此尋找高效的培養(yǎng)、富集CSC的方法具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)需要。研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但是CSC與EMT關(guān)系的研究卻少有報(bào)道，進(jìn)一步揭示CSC與EMT的內(nèi)在機(jī)制將有利于腫瘤的診療。我們將人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞株在無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中培養(yǎng)形成DLD-1細(xì)胞球(DLD-S)，并探討具有腫瘤干細(xì)胞特征的球細(xì)胞發(fā)生EMT與其遷移、侵襲等惡性行為之間的聯(lián)系。 　　

　　材料和方法 　　

　　1.材料:人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科實(shí)驗(yàn)室提供;細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)膠購(gòu)自Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;Transwell小室購(gòu)自BD公司;赫鈣蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin、緊密連接蛋白(ZO-1),Snail抗體購(gòu)自CST公司;CD133抗體購(gòu)自美天妮公司;CD166、富含亮氨酸重復(fù)序列G一蛋白偶聯(lián)受體5(LgrS)抗體購(gòu)自Santa公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司;引物由Invitxogen公司合成。 　　

　　2.細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:DLD-1細(xì)胞在含10%FBSRPMI1640培養(yǎng)基中于370C,5%CO:飽和濕度條件下培養(yǎng)。SFM配制:DMEM/Fl2培養(yǎng)基中加人10},g/L表皮生長(zhǎng)因子、10},g/i堿性成纖維生長(zhǎng)因子、0.4%牛血清自蛋白、Sm擴(kuò)L胰島素、20l0B273.Real-timePCR;Trizol法提RNA及逆轉(zhuǎn)錄、Real-timePCR步驟按說(shuō)明書(shū)操作，每孔設(shè)3復(fù)孔序列如下:5-GCCCTGCCAATCCCGATG.1AA-3(E-cadherin上游)，5-GGGGTCAGTATCAGCCGCT-3(E一cadherin下游);5-TGAGGCAGCTCACATAATGC-3(Zi)一1上游)，5-GGGAGTTGGGGTTCATAGGT-3(Z0-1下游沙;s一CTTCAGAGAGAGGAAGCCGAAAA-3(Vimentin上游),5-CCGTGAGGTCAGGCTTGGAAA-3(Vimentin下游);s-CCAGACCCACTCAGATC}T-CAAGAA-3(Snail上游)，s-GGCAGAGGACA-CAGAACCAGAAAA-3(Snail下游);s-ACCGACT-GAGACCCAACATC-3(CD133上游)，5-GACCG-CAGGCTAGTTT"fCAC-3(CD133下游);s-CGCAAT-GCAACAGGAGACTA-3(CD166上游)，5-CCA-CAGTTGCATTCGTGCTA-3(CD166下游);s-CTCT-TCCTCAAACCGTCTGC-3(Lgrs上游)，s-GATCG-GAGGCTAAGCAACTG-3(L護(hù)下游)5-GGGGAGC-CAAAAGGGTCATCATCT-3「甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游l，5-GACGCCfGCffCACCACCTTCT-T(>-3(GAPD只下游)。 　　

　　4.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):ECM膠用預(yù)冷無(wú)血清培養(yǎng)基按1:9稀釋。Transwell小室中每孔加人稀釋后ECM膠40閃，}7℃孵育sh后每孔加70閃無(wú)血清培養(yǎng)基，370C孵育30min后吸棄培養(yǎng)基。每孔加含有2x105細(xì)胞的細(xì)胞懸液200閃于上室，下室加人600閃含20%FBS的培養(yǎng)基，約20h后用0.1%結(jié)晶紫乙醇溶液固定1sruin，棉簽擦掉上曰細(xì)胞。200倍顯微鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野，觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Transwell遷移實(shí)驗(yàn):不用ECM膠，其余步驟一致。 　　

　　5.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn):配制1.2%下層膠和0.6%上層膠，6孔板下層培養(yǎng)基為1.5ml(0.75ml含200}oFBS的2xRPMI1640培養(yǎng)基+0.75ml1.2%下層膠)，待下層膠凝固后加人1ml上層培養(yǎng)基((0.5ml含20%FBS的2xRPMI1640培養(yǎng)基+0.5ml0.6%上層膠+5000個(gè)細(xì)胞)，待上層膠凝固后放人培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lOd后在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù))50的克隆，并進(jìn)行統(tǒng)　　計(jì)學(xué)分析。 　　

　　6.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn):消化調(diào)整細(xì)胞濃度，PBS重懸后，每點(diǎn)注射200閃含有1xlOG個(gè)細(xì)胞為宜，注射后夾閉針孔巧s防止液體流出。每天觀察記錄裸鼠狀態(tài)和腫瘤情況，60d后處死裸鼠，對(duì)瘤體行后續(xù)相關(guān)分析7.}esternblot實(shí)驗(yàn):將樣本測(cè)蛋白濃度后，取50},g總蛋白上樣電泳，取出凝膠切取目的條帶，用蒸餾水沖洗，取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電泳緩沖液中，后按照條件轉(zhuǎn)膜。 　　

　　轉(zhuǎn)膜后用含5%r脫脂牛奶TEST封閉液浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h，取稀釋后一抗浸泡孵育PVDF膜，4℃過(guò)夜次日孵育二抗后，顯色曝光獲得條帶，掃描膠片獲得灰度值行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果
　　1.細(xì)胞球的形成及球細(xì)胞自我更新與分化:腫瘤細(xì)胞在SEM中懸浮培養(yǎng)可形成具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞球，第5天開(kāi)始可以觀察到典型的DLD-S懸浮細(xì)胞球，此后細(xì)胞球逐漸增大增多。將其消化后再次接種于SFM中，5d左右仍可形成細(xì)胞球，形態(tài)與之前相同且能持續(xù)傳代，提示DLD-S具有自我更新能力。將DLD-S接種于含10%FBS的培養(yǎng)基中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)形態(tài)與DLD-1細(xì)胞無(wú)明顯差異，顯示DLD-S細(xì)胞具有分化能力。 　　

　　2.DLD-S細(xì)胞中富集更多的CD133十細(xì)胞:CD133是結(jié)腸癌CSC經(jīng)典的標(biāo)志之一，我們采用流式細(xì)胞術(shù)分析了DLD-S及DLD-1細(xì)胞中CD133表達(dá)，結(jié)果顯示DLD-S中CD133+比例為(2.90士0.20)%,DLD-1中為(0.9010.05)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)0顯示采用SFM培養(yǎng)可以富集CSC。 　　

　　3.DLD-S具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力:我們通過(guò)Transwell法檢測(cè)了2種細(xì)胞的遷移、侵襲能力。結(jié)果顯示:在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)視野DLD-1細(xì)胞數(shù)為(112士5)個(gè)，而DLD-感為(206士8)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中每個(gè)視野DLD-1細(xì)胞數(shù)為(59土5)個(gè)，DLD-S為(108士9)個(gè)，顯示DLD-S的侵襲及轉(zhuǎn)移能力明顯增加(P<0.05)}
　　

　　4.DLD-S具有更強(qiáng)的體內(nèi)外成瘤能力:分別用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)研究?jī)煞N細(xì)胞體內(nèi)和體外的成瘤能力差異，結(jié)果顯示，DLD-s比較DLD-1具有更強(qiáng)的克隆形成能力，表現(xiàn)為克隆數(shù)目明顯增多，克隆明顯增大(克隆數(shù)為698士21比172士7,P<0.05)。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，在皮下注射60d后麻醉處死裸鼠，解剖瘤體分析發(fā)現(xiàn)DLD-S具有更強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力。表現(xiàn)為瘤體更大(P<0.05)5.DLD-S高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞基因:采用Real-tunePCR及Westernblot檢測(cè)了EMT及結(jié)腸癌CSC相關(guān)基因信使RNA(mRNA)及蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果顯示，DLD-S高表達(dá)如CD133,CD166,Lgr5結(jié)腸癌CSC基因(P<0.05)。雖然上皮基因E-cadherin高表達(dá)，但是ZO-1表達(dá)卻降低，同時(shí)間質(zhì)基因Vimentin,Snail表達(dá)上升，提示DLD-S已發(fā)生EMT(P<0.05,圖1,2)。 　　

　　討論
　　結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是制約臨床療效的關(guān)鍵因素，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機(jī)制的深入研究對(duì)于腫瘤的治療有重要意義。研究表明腫瘤中一小部分具有十細(xì)胞特征的CSC將是非常關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)。目前主要通過(guò)一些細(xì)胞表面標(biāo)志如CD133,CD44,CDI66,LgrS,EpCAM,ALDHl等及是否能夠排出Hoechst33342染料來(lái)分選收集CSC}4-11J。但結(jié)腸癌4JC所占比例相當(dāng)少，這制約了結(jié)腸癌CJIa的提取和純化，嚴(yán)重影響了對(duì)C}C的進(jìn)一步研究而SFM培養(yǎng)能夠富集CSC，可在一定程度上解決上述難題〔CSC具有強(qiáng)大的自我更新與分化能力，在體內(nèi)外具有更強(qiáng)的成瘤能力。本研究結(jié)果顯示，SFM培養(yǎng)收集的DLD-S具有更強(qiáng)的自我更新與分化能力，具有CSC,的特征。我們采用腫瘤研究中經(jīng)典的裸鼠皮下成瘤和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證DLD-S細(xì)胞的體內(nèi)、體外成瘤能力，結(jié)果顯示，比較DLD-1細(xì)胞，DLD-S細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的體內(nèi)外成瘤能力，這與之前其他研究者的報(bào)道相符。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是其惡性行為的重要體現(xiàn)，我們通過(guò)『1ranswell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)證明rDLD-S細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，符合結(jié)腸癌CSC的特點(diǎn)。為了證明DLD-S與CSC的相關(guān)性特征，我們采用Real-timeYCP},Westernblot的方法檢測(cè)了DLD-S細(xì)胞中C:SC基閃的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著DLD-S惡性行為的增加，細(xì)胞中的CD133,CDI66,Lgr}表達(dá)也增加了;另外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示DLD-S中CD133十細(xì)胞明顯增加。它說(shuō)明DLD-S中確實(shí)富集了結(jié)腸癌CSCEMT是指細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞間連接分子降解、細(xì)胞骨架重塑獲得更強(qiáng)的遷移、運(yùn)動(dòng)能力。伴隨著仁皮細(xì)胞標(biāo)志如E-cadherin,ZO-l的表達(dá)下降，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志如Vimentin,Snail表達(dá)增高。研究顯示腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT可以明顯提高其侵襲、轉(zhuǎn)移等能力，且進(jìn)一步表達(dá)CSC相關(guān)基因，提示EMT可能參與了腫瘤的進(jìn)展。根據(jù)腫瘤十細(xì)胞理論，CSC介導(dǎo)了腫瘤的一系列惡性行為，因此進(jìn)一步揭示CSC與E1}}IT的關(guān)系具有重要的科學(xué)價(jià)值，而國(guó)內(nèi)外對(duì)此報(bào)道還相對(duì)較少。有鑒于此，我們檢測(cè)了DLD-S的EMT相關(guān)基因表達(dá)情況，結(jié)果顯不隨著腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、成瘤能力增加及CD133,CD166,LgrS的表達(dá)升高，DLD-S中間質(zhì)基因Vimentin和Snail表達(dá)明顯增加，上皮基因ZO-I表達(dá)下降，提示DLD-S細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了EMT另外，可見(jiàn)在DLD-S中E-cadherin表達(dá)也明顯增加，E-cadherin被認(rèn)為是EMT中極重要的調(diào)節(jié)因子，有研究結(jié)果顯示:E-cadherin高表達(dá)可抑制EMT，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性行為下降的報(bào)道。雖然E-cadherin的表達(dá)與我們的預(yù)期不符，但是腫瘤CSC與普通腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性大，我們認(rèn)為在結(jié)腸癌CSC中E-cadhei}in可能還不是獨(dú)立的介導(dǎo)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為的基因，在CSC中可能還有其他基因在促進(jìn)CSC惡性行為的同時(shí)對(duì)E-cadherin進(jìn)行調(diào)控導(dǎo)致其表達(dá)增加。Nam的研究也從側(cè)面證明了我們的觀點(diǎn)‘al我們通過(guò)在SFM中培養(yǎng)DLD-1細(xì)胞獲得細(xì)胞球，證實(shí)了球細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移、成瘤能力;且CSC細(xì)胞數(shù)量增加，相關(guān)CSC基因表達(dá)增加。證明了DLD-S中確實(shí)富集了結(jié)腸癌CSC，具有腫瘤干細(xì)胞的特征。同時(shí)，我們檢測(cè)了球細(xì)胞中EMT相關(guān)基因表達(dá)，可見(jiàn)伴隨著上皮細(xì)胞基因ZO-1的下降，間質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)上升，提示細(xì)胞發(fā)生了EMT雖然上皮基因E-cadherin表達(dá)上升，但是考慮到CSC與普通腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，同一基因在此兩類細(xì)胞中可能發(fā)揮完全不同的功能，結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們認(rèn)為DLD-S細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了EMT。本研究結(jié)果顯示，無(wú)血清懸浮培養(yǎng)結(jié)腸癌所形成的球細(xì)胞，具有腫瘤干細(xì)胞的特征，其轉(zhuǎn)移相關(guān)特性與EMT有著密切的聯(lián)系。 　　

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