肝纖維化患者“益肝康”藥物血清對HSCs胞漿游離鈣的影響

作者：王軍民,劉石萍,方澍名,姚希賢　　　作者單位：河北省邯鄲市中心醫(yī)院;河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院

　　【摘要】 目的：探討經用慢性乙型肝炎患者制備的“益肝康”藥物血清對血管緊張素Ⅱ介導的HSCs胞漿游離鈣變化的影響。方法　采用體外HSCs株培養(yǎng)技術?；颊哐宸譃锳組：服用“益肝康”前;B組：服用“益肝康”后。藥物血清的制備：15例觀察對象服藥前采靜脈血5 ml，然后給予“益肝康”150 ml，2次/d，療程7 d時作為觀察終點。服用“益肝康”前后，均于晨起外周靜脈取血。采用盲法，用上述10%藥物血清培養(yǎng)HSCs24 h，再將經藥物血清預處理的HSCs及對照組細胞負載Fluo-3/AM后使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測Ca2+i。結果　經“益肝康”藥物血清預處理HSCs后均可明顯減低細胞Ca2+i，熒光強度相對值與經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比，Ca2+i下降達52.37%，兩者相比有顯著性差異(P<0.01)。給予Ang-Ⅱ(1.1×10-7mol/L)刺激HSCs，經“益肝康”藥物血清預處理的HSCs，細胞Ca2+i 熒光強度變化百分數(shù)明顯減低，同經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比，下降達90.50%，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論　來自慢性乙型肝炎患者的"益肝康"藥物血清具有抑制HSCs胞漿內游離鈣水平升高的作用。

　　【關鍵詞】 肝纖維化;肝星狀細胞;血清藥理學;胞漿游離鈣;c-fos;c-jun;細胞外信號調節(jié)蛋白激酶;c-Jun氨基末端激酶

　　肝纖維化(LF)是所有慢性肝病進展成肝硬化的必經階段，而肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)則是肝星狀細胞(HSCs)的活化與增殖，因此抑制HSCs 活化與增殖則成為阻止并逆轉肝纖維化的主要途徑之一。經大量臨床與基礎研究證實，中藥有效方劑“益肝康”對肝纖維化有相當?shù)闹委熥饔肹1]。目前尚乏慢性乙型肝炎患者“益肝康”藥物血清對HSCs細胞內Ca2+信號轉導機制影響的研究。本實驗采用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)與第三代鈣熒光探針Fluo-3/AM技術，觀察經用慢性乙型肝炎患者制備的“益肝康”藥物血清對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)介導的HSCs胞漿游離鈣(Ca2+i)變化的影響。

　　1　資料與方法

　　1.1　一般資料

　　病例選擇：河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內科門診就診及病房住院之慢性乙型肝炎患者。

　　1.2　納入標準

　　(1)符合5中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會肝病學分會、病毒性肝炎防治方案6慢性乙型肝炎診斷標準;(2)年齡18～55歲，性別男性;(3)HBVDNA(+)的“小三陽”患者;(4)肝纖維化血清標志物肝纖四項(HA、LN、PⅢP、IV-7s)有陽性表現(xiàn);(5)影像學檢查脾臟脾門處厚度4～4.5 cm，門靜脈主干及脾門靜脈內徑正常;(6)研究期間同意不服用免疫調節(jié)劑、退黃藥物及其他中藥。

　　1.3　排除標準

　　(1)合并其他類型肝炎者;(2)嚴重心、腎疾患者;(3)膽紅素>5ULN;(4)近期(6個月)應用免疫抑制或增強劑者;(5)肝硬化失代償期患者。

　　1.4　細胞株

　　肝星狀細胞株CFSC由美國Greenwel教授建株并惠贈，其表型為活化的HSCs，從四氯化碳(CCl4)誘發(fā)的肝硬化大鼠中分離并通過培養(yǎng)使細胞自發(fā)獲得永生性[4]，冷凍保存于液氮中。

　　1.5　液體配制

　　1.5.1　正常含鈣細胞培養(yǎng)液/臺氏液：NaCl 130 mmol/L， KCl 2.7 mmol/L， CaCl2 1.5 mmol/L， MgCl2 2 mmol/L， HEPES 10 mmol/L， glucose 10 mmol/L， pH值7.4(NaOH)。

　　1.5.2　青霉素、鏈霉素雙抗溶液：使用濃度青霉素為100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml，配成100倍貯存液，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br />
　　1.6　方法

　　1.6.1　藥物血清的提取及細胞培養(yǎng)：采用改良血清藥理學方法，即采用慢性乙型肝炎患者進行藥物實驗，再提取藥物血清進行體外細胞培養(yǎng)，使體外實驗盡量準確再現(xiàn)在體藥物與機體相互作用過程。

　　1.6.2　患者血清分組：A組：服用“益肝康”前;B組：服用“益肝康”后。

　　1.6.3　藥物血清的制備：征求患者同意，簽定同意書，15名觀察對象服藥前采靜脈血5 ml，然后給予“益肝康”150 ml(1袋),2 次/d，療程7 d時作為觀察終點。服用“益肝康”前后，均于晨起外周靜脈取血，常溫靜置3 h,4℃離心，3 000 r/min，20 min，分離血清，其中有溶血者棄之不用。同組血清合并混勻，56℃×30 min水浴滅活，用0.22 μm濾器過濾除菌，-70℃保存?zhèn)溆谩?br />
　　1.6.4　細胞培養(yǎng)

　　將冷凍保存于液氮中的HSCs復蘇后接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L L-谷氨酰胺及1 mol/LHEPES的10%RPMI-1640培養(yǎng)液(pH值7.4)中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞呈單層致密狀時，用0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3傳代，24 h換液，72 h再次傳代。

　　1.6.5　實驗分組：每次實驗均在呈指數(shù)生長的細胞中進行，將2 cm×2 cm蓋玻片預先放置在6孔培養(yǎng)板，細胞消化后以1.0×104/ml的密度接種2 ml制備爬片，培養(yǎng)箱中孵育至細胞80%融合時，棄培養(yǎng)液，換不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞基本同步化于G0期后進行實驗。實驗細胞分組如下(n=8)：A組為服用“益肝康”前血清干預組;B組為服用“益肝康”后藥物血清干預組

　　1.6.6　藥物血清預處理：將上述爬片細胞分為2組，每孔加入10% RPMI-1640培養(yǎng)液900 μl，然后各實驗孔采用盲法分別給予A組藥物血清或B組血清100 μl，終濃度為10%。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗。

　　1.7　檢測胞漿游離鈣

　　采用盲法，用10%藥物血清培養(yǎng)HSCs24 h，再將經藥物血清預處理的HSCs及對照組細胞負載Fluo-3/AM后使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測Ca2+i。

　　1.8　統(tǒng)計學分析

　　應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x-±s表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

　　2　結果

　　2.1　HSCs的Ca2+熒光成像

　　LSCM下Ca2+成像的HSCs仍可見普通倒置顯微鏡下的形態(tài)特征，細胞Ca2+i的濃度的高低由細胞被激發(fā)出的熒光強弱表示，熒光強度越強，表示Ca2+i濃度越高，反之則越低。本實驗HSCs與Fluo-3/AM孵育后，所有細胞均被染色，且每組各細胞間的強度基本一致。

　　2.2　靜息狀態(tài)下HSCsCa2+i的動態(tài)變化

　　為證明細胞培養(yǎng)液本身對HSCsCa2+i的影響，本研究觀察了6個HSCs在實驗所需的時間內(5 min)Ca2+i的動態(tài)變化，結果表明，HSCs在實驗所需的整個時間內Ca2+i熒光強度基本保持穩(wěn)定。

　　2.3　不同濃度Ang-Ⅱ對HSCs的累積反應曲線

　　加入濃度梯度Ang-Ⅱ后，HSCs熒光強度逐漸增加，作出累積反應曲線后，得到EC50值約為1.1×10-7 mol/L。

　　2.4　“益肝康”藥物血清對HSCsCa2+i的影響

　　經“益肝康”藥物血清預處理HSCs后均可明顯減低細胞Ca2+i，熒光強度相對值(FI)與經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比，Ca2+i下降達52.37%，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

　　2.5　“益肝康”藥物血清對Ang-Ⅱ介導的HSCsCa2+i變化的影響

　　給予Ang-Ⅱ(1.1×10-7 mol/L)刺激HSCs，經“益肝康”藥物血清預處理的HSCs，細胞Ca2+i熒光強度變化百分數(shù)(CRF)明顯減低，同經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比，下降達90.50%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。“益肝康”藥物血清對HSCs胞漿游離鈣熒光強度相對值的影響, “益肝康”藥物血清漿游高鈣熒光強度變化百分數(shù)的影響　“益肝康”藥物血清對胞漿游離鈣熒光強度相對值及變化百分數(shù)的影響

　　3　討論

　　目前研究認為，生物信號跨膜轉導的基本途徑包括cAMP、cGMP、三磷酸肌醇(IP3)和Ca2+等系統(tǒng)。其中作為“信使”的Ca2+尤為重要，而其在細胞內濃度的增加是細胞增殖分裂不可缺少的條件。在HSCs活化過程中，其胞漿內Ca2+的是諸多生長因子、細胞因子及氧化應激產物等發(fā)揮促生長和增殖作用的主要介質之一。近的許多實驗證實，HSCs上存在著L型-電壓依賴性鈣通道(L型-VOCC)， Oide等[2]發(fā)現(xiàn)HSCs尚含有T型電壓依賴性鈣通道(T型-VOCC)，且可被TGF- 1激活。細胞外Ca2+可通過被激活的Ca2+通道流入細胞內，加之胞內鈣庫受損使Ca2+大量釋放，引起Ca2+i持續(xù)性升高，細胞內外Ca2+i梯度降低，細胞去極化，興奮性增加，從而激活HSCs，使其增殖并大量表達膠原蛋白，加速肝纖維化的形成。郭傳勇等[3]觀察內皮素-1對培養(yǎng)鼠肝星狀細胞的影響，發(fā)現(xiàn)內皮素-1在促進HSCs增殖及膠原合成的同時，細胞內游離鈣的水平也顯著升高，且Ca2+i濃度升高呈雙相反應，一是快速短暫的瞬時峰值升高相(Ⅰ相);二是緩慢持久升高相 (Ⅱ相)。而且上述作用呈劑量依賴關系。推測Ⅱ相升高起主要作用，可進一步激活c-fos、c-myc等癌基因表達，籍此調節(jié)HSCs細胞分裂和增殖的功能，并使HSCs分泌ECM能力增強。鐘敏章等[4]在實驗中發(fā)現(xiàn)，用漢防己堿及維拉帕米治療可使HSCs 數(shù)目減少，內質網(wǎng)面積減少，線粒體、高爾基體產生與分泌膠原的細胞器均受到抑制，說明鈣通道阻斷劑抗肝纖維化作用部分與其抑制 HSCs 增殖及其向肌成纖維樣細胞轉化有關，也暗示Ca2+i在HSCs活化與增殖中起著重要作用。

　　有研究表明，丹參及其提取物可抑制心肌細胞及內皮細胞應激所致鈣超載[5]，本實驗結果表明，經慢性乙型肝炎患者提取的“益肝康”藥物血清預處理HSCs，與服藥前提取的患者血清預處理HSCs相比，前者鈣熒光強度明顯低于后者(P<0.01)，顯示“益肝康”藥物血清顯著抑制了HSCs細胞內鈣的升高。其機制可能是經含藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，藥物發(fā)揮了其抑制HSCs鈣動員的作用，推測該作用可能與“益肝康”的主藥-丹參阻斷了HSCs細胞膜上的L型-VOCC從而減少了鈣離子的內流有關。

　　本研究結果顯示，在受到不同濃度的AngⅡ刺激時，HSCsCa2+i與AngⅡ成量效關系。提示AngⅡ可以通過提高Ca2+i而在HSCs的增殖中發(fā)揮重要作用。本實驗結果尚表明，給予Ang-Ⅱ刺激后，“益肝康”藥物血清預處理的HSCs，其Ca2+i熒光強度變化百分數(shù)明顯低于服藥前血清預處理的HSCs(P<0.001)，提示“益肝康”阻斷或抑制了HSCs的Ang-Ⅱ信號轉導通路，該通路可能是Ang-Ⅱ激活的受體依賴性鈣通道(ROCC)，從而抑制了其致HSCs內鈣升高的作用，并因此抑制HSCs活化與增殖。此機制可能與 “益肝康”的主要組分——丹參下調AT-1受體水平密切相關。