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肝纖維化患者“益肝康”藥物血清對HSCs胞漿游離鈣的影響

文章來源:創(chuàng)新醫(yī)學網(wǎng)發(fā)布日期:2012-02-14瀏覽次數(shù):40377

作者:王軍民,劉石萍,方澍名,姚希賢   作者單位:河北省邯鄲市中心醫(yī)院;河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院

  【摘要】 目的:探討經用慢性乙型肝炎患者制備的“益肝康”藥物血清對血管緊張素Ⅱ介導的HSCs胞漿游離鈣變化的影響。方法 采用體外HSCs株培養(yǎng)技術?;颊哐宸譃锳組:服用“益肝康”前;B組:服用“益肝康”后。藥物血清的制備:15例觀察對象服藥前采靜脈血5 ml,然后給予“益肝康”150 ml,2次/d,療程7 d時作為觀察終點。服用“益肝康”前后,均于晨起外周靜脈取血。采用盲法,用上述10%藥物血清培養(yǎng)HSCs24 h,再將經藥物血清預處理的HSCs及對照組細胞負載Fluo-3/AM后使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測Ca2+i。結果 經“益肝康”藥物血清預處理HSCs后均可明顯減低細胞Ca2+i,熒光強度相對值與經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比,Ca2+i下降達52.37%,兩者相比有顯著性差異(P<0.01)。給予Ang-Ⅱ(1.1×10-7mol/L)刺激HSCs,經“益肝康”藥物血清預處理的HSCs,細胞Ca2+i 熒光強度變化百分數(shù)明顯減低,同經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比,下降達90.50%,兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論 來自慢性乙型肝炎患者的"益肝康"藥物血清具有抑制HSCs胞漿內游離鈣水平升高的作用。

  【關鍵詞】 肝纖維化;肝星狀細胞;血清藥理學;胞漿游離鈣;c-fos;c-jun;細胞外信號調節(jié)蛋白激酶;c-Jun氨基末端激酶

  肝纖維化(LF)是所有慢性肝病進展成肝硬化的必經階段,而肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)則是肝星狀細胞(HSCs)的活化與增殖,因此抑制HSCs 活化與增殖則成為阻止并逆轉肝纖維化的主要途徑之一。經大量臨床與基礎研究證實,中藥有效方劑“益肝康”對肝纖維化有相當?shù)闹委熥饔肹1]。目前尚乏慢性乙型肝炎患者“益肝康”藥物血清對HSCs細胞內Ca2+信號轉導機制影響的研究。本實驗采用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)與第三代鈣熒光探針Fluo-3/AM技術,觀察經用慢性乙型肝炎患者制備的“益肝康”藥物血清對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)介導的HSCs胞漿游離鈣(Ca2+i)變化的影響。

  1 資料與方法

  1.1 一般資料

  病例選擇:河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內科門診就診及病房住院之慢性乙型肝炎患者。

  1.2 納入標準

  (1)符合5中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會肝病學分會、病毒性肝炎防治方案6慢性乙型肝炎診斷標準;(2)年齡18~55歲,性別男性;(3)HBVDNA(+)的“小三陽”患者;(4)肝纖維化血清標志物肝纖四項(HA、LN、PⅢP、IV-7s)有陽性表現(xiàn);(5)影像學檢查脾臟脾門處厚度4~4.5 cm,門靜脈主干及脾門靜脈內徑正常;(6)研究期間同意不服用免疫調節(jié)劑、退黃藥物及其他中藥。

  1.3 排除標準

  (1)合并其他類型肝炎者;(2)嚴重心、腎疾患者;(3)膽紅素>5ULN;(4)近期(6個月)應用免疫抑制或增強劑者;(5)肝硬化失代償期患者。

  1.4 細胞株

  肝星狀細胞株CFSC由美國Greenwel教授建株并惠贈,其表型為活化的HSCs,從四氯化碳(CCl4)誘發(fā)的肝硬化大鼠中分離并通過培養(yǎng)使細胞自發(fā)獲得永生性[4],冷凍保存于液氮中。

  1.5 液體配制

  1.5.1 正常含鈣細胞培養(yǎng)液/臺氏液:NaCl 130 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L, CaCl2 1.5 mmol/L, MgCl2 2 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, glucose 10 mmol/L, pH值7.4(NaOH)。

  1.5.2 青霉素、鏈霉素雙抗溶液:使用濃度青霉素為100 U/ml,鏈霉素100 μg/ml,配成100倍貯存液,-20℃貯存?zhèn)溆谩?br />
  1.6 方法

  1.6.1 藥物血清的提取及細胞培養(yǎng):采用改良血清藥理學方法,即采用慢性乙型肝炎患者進行藥物實驗,再提取藥物血清進行體外細胞培養(yǎng),使體外實驗盡量準確再現(xiàn)在體藥物與機體相互作用過程。

  1.6.2 患者血清分組:A組:服用“益肝康”前;B組:服用“益肝康”后。

  1.6.3 藥物血清的制備:征求患者同意,簽定同意書,15名觀察對象服藥前采靜脈血5 ml,然后給予“益肝康”150 ml(1袋),2 次/d,療程7 d時作為觀察終點。服用“益肝康”前后,均于晨起外周靜脈取血,常溫靜置3 h,4℃離心,3 000 r/min,20 min,分離血清,其中有溶血者棄之不用。同組血清合并混勻,56℃×30 min水浴滅活,用0.22 μm濾器過濾除菌,-70℃保存?zhèn)溆谩?br />
  1.6.4 細胞培養(yǎng)

  將冷凍保存于液氮中的HSCs復蘇后接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L L-谷氨酰胺及1 mol/LHEPES的10%RPMI-1640培養(yǎng)液(pH值7.4)中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞呈單層致密狀時,用0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3傳代,24 h換液,72 h再次傳代。

  1.6.5 實驗分組:每次實驗均在呈指數(shù)生長的細胞中進行,將2 cm×2 cm蓋玻片預先放置在6孔培養(yǎng)板,細胞消化后以1.0×104/ml的密度接種2 ml制備爬片,培養(yǎng)箱中孵育至細胞80%融合時,棄培養(yǎng)液,換不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細胞基本同步化于G0期后進行實驗。實驗細胞分組如下(n=8):A組為服用“益肝康”前血清干預組;B組為服用“益肝康”后藥物血清干預組

  1.6.6 藥物血清預處理:將上述爬片細胞分為2組,每孔加入10% RPMI-1640培養(yǎng)液900 μl,然后各實驗孔采用盲法分別給予A組藥物血清或B組血清100 μl,終濃度為10%。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗。

  1.7 檢測胞漿游離鈣

  采用盲法,用10%藥物血清培養(yǎng)HSCs24 h,再將經藥物血清預處理的HSCs及對照組細胞負載Fluo-3/AM后使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測Ca2+i。

  1.8 統(tǒng)計學分析

  應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件,計量資料以x-±s表示,采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

  2 結果

  2.1 HSCs的Ca2+熒光成像

  LSCM下Ca2+成像的HSCs仍可見普通倒置顯微鏡下的形態(tài)特征,細胞Ca2+i的濃度的高低由細胞被激發(fā)出的熒光強弱表示,熒光強度越強,表示Ca2+i濃度越高,反之則越低。本實驗HSCs與Fluo-3/AM孵育后,所有細胞均被染色,且每組各細胞間的強度基本一致。

  2.2 靜息狀態(tài)下HSCsCa2+i的動態(tài)變化

  為證明細胞培養(yǎng)液本身對HSCsCa2+i的影響,本研究觀察了6個HSCs在實驗所需的時間內(5 min)Ca2+i的動態(tài)變化,結果表明,HSCs在實驗所需的整個時間內Ca2+i熒光強度基本保持穩(wěn)定。

  2.3 不同濃度Ang-Ⅱ對HSCs的累積反應曲線

  加入濃度梯度Ang-Ⅱ后,HSCs熒光強度逐漸增加,作出累積反應曲線后,得到EC50值約為1.1×10-7 mol/L。

  2.4 “益肝康”藥物血清對HSCsCa2+i的影響

  經“益肝康”藥物血清預處理HSCs后均可明顯減低細胞Ca2+i,熒光強度相對值(FI)與經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比,Ca2+i下降達52.37%,兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

  2.5 “益肝康”藥物血清對Ang-Ⅱ介導的HSCsCa2+i變化的影響

  給予Ang-Ⅱ(1.1×10-7 mol/L)刺激HSCs,經“益肝康”藥物血清預處理的HSCs,細胞Ca2+i熒光強度變化百分數(shù)(CRF)明顯減低,同經服藥前患者血清預處理HSCs組結果相比,下降達90.50%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。“益肝康”藥物血清對HSCs胞漿游離鈣熒光強度相對值的影響, “益肝康”藥物血清漿游高鈣熒光強度變化百分數(shù)的影響 “益肝康”藥物血清對胞漿游離鈣熒光強度相對值及變化百分數(shù)的影響

  3 討論

  目前研究認為,生物信號跨膜轉導的基本途徑包括cAMP、cGMP、三磷酸肌醇(IP3)和Ca2+等系統(tǒng)。其中作為“信使”的Ca2+尤為重要,而其在細胞內濃度的增加是細胞增殖分裂不可缺少的條件。在HSCs活化過程中,其胞漿內Ca2+的是諸多生長因子、細胞因子及氧化應激產物等發(fā)揮促生長和增殖作用的主要介質之一。近的許多實驗證實,HSCs上存在著L型-電壓依賴性鈣通道(L型-VOCC), Oide等[2]發(fā)現(xiàn)HSCs尚含有T型電壓依賴性鈣通道(T型-VOCC),且可被TGF- 1激活。細胞外Ca2+可通過被激活的Ca2+通道流入細胞內,加之胞內鈣庫受損使Ca2+大量釋放,引起Ca2+i持續(xù)性升高,細胞內外Ca2+i梯度降低,細胞去極化,興奮性增加,從而激活HSCs,使其增殖并大量表達膠原蛋白,加速肝纖維化的形成。郭傳勇等[3]觀察內皮素-1對培養(yǎng)鼠肝星狀細胞的影響,發(fā)現(xiàn)內皮素-1在促進HSCs增殖及膠原合成的同時,細胞內游離鈣的水平也顯著升高,且Ca2+i濃度升高呈雙相反應,一是快速短暫的瞬時峰值升高相(Ⅰ相);二是緩慢持久升高相 (Ⅱ相)。而且上述作用呈劑量依賴關系。推測Ⅱ相升高起主要作用,可進一步激活c-fos、c-myc等癌基因表達,籍此調節(jié)HSCs細胞分裂和增殖的功能,并使HSCs分泌ECM能力增強。鐘敏章等[4]在實驗中發(fā)現(xiàn),用漢防己堿及維拉帕米治療可使HSCs 數(shù)目減少,內質網(wǎng)面積減少,線粒體、高爾基體產生與分泌膠原的細胞器均受到抑制,說明鈣通道阻斷劑抗肝纖維化作用部分與其抑制 HSCs 增殖及其向肌成纖維樣細胞轉化有關,也暗示Ca2+i在HSCs活化與增殖中起著重要作用。

  有研究表明,丹參及其提取物可抑制心肌細胞及內皮細胞應激所致鈣超載[5],本實驗結果表明,經慢性乙型肝炎患者提取的“益肝康”藥物血清預處理HSCs,與服藥前提取的患者血清預處理HSCs相比,前者鈣熒光強度明顯低于后者(P<0.01),顯示“益肝康”藥物血清顯著抑制了HSCs細胞內鈣的升高。其機制可能是經含藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,藥物發(fā)揮了其抑制HSCs鈣動員的作用,推測該作用可能與“益肝康”的主藥-丹參阻斷了HSCs細胞膜上的L型-VOCC從而減少了鈣離子的內流有關。

  本研究結果顯示,在受到不同濃度的AngⅡ刺激時,HSCsCa2+i與AngⅡ成量效關系。提示AngⅡ可以通過提高Ca2+i而在HSCs的增殖中發(fā)揮重要作用。本實驗結果尚表明,給予Ang-Ⅱ刺激后,“益肝康”藥物血清預處理的HSCs,其Ca2+i熒光強度變化百分數(shù)明顯低于服藥前血清預處理的HSCs(P<0.001),提示“益肝康”阻斷或抑制了HSCs的Ang-Ⅱ信號轉導通路,該通路可能是Ang-Ⅱ激活的受體依賴性鈣通道(ROCC),從而抑制了其致HSCs內鈣升高的作用,并因此抑制HSCs活化與增殖。此機制可能與 “益肝康”的主要組分——丹參下調AT-1受體水平密切相關。